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一、概述

NHS 活化的瓊脂糖磁珠（Magarose-NHS）將蛋白質簡單**地共價固定到磁珠載體上，為抗體、抗原或其他生物分子的親和純化提供了有價值的方法。活化的瓊脂糖磁珠含有能夠與蛋白質或其他分子上的伯胺反應形成穩定的酰胺鍵的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）官能團。耦合反應在 pH 7~9 的無胺緩沖液中進行。不管配體的分子量或等電點（PI）耦合反應的效率均大于 80%。一旦配體被固定，所制備的瓊脂糖磁珠即可以被應用到多重親和純化程序中。 

二、產品特性

注：磁珠蛋白結合量與目標蛋白特性相關，此處僅作參考值。

三、使用方法

1. 緩沖液

所有的水和緩沖液均用 0.22 μm 或 0.45 μm 的濾膜進行過濾。

① Washing Buffer A: 1 mM 鹽酸，使用前冷卻到 4ºC;

② Coupling Buffer A: 100 mM 2-嗎啉乙磺酸 MES，pH 4.8（用于等電點小于 7 的生物分子的偶聯）;

③ Coupling Buffer B: 200 mM NaHCO₃， pH 8.3（用于等電點大于 7 的生物分子的偶聯）;

④ Blocking Buffer: 3 M 乙醇胺，pH 9.0;

⑤ Storage Buffer: 含質量分數為 0.05%疊氮化鈉的 PBS 緩沖液或者根據客戶自己需求采用其他緩沖液。

2. 流程關鍵點

1)        其中磁珠洗滌要嚴格按照說明書采用冷卻的 Washing Buffer A（①）快速洗滌 ，以防磁珠在洗滌過程中 NHS 基團水解；

2)        蛋白偶聯過程中，**要通過實驗確定合適的 Coupling Buffer（主要包括 Coupling Buffer A（②）、Coupling Buffer B（③）、50 mM 硼酸溶液pH 8.5、100mM磷酸緩沖液，100mM NaCl，pH7.4這四種）；

3)        確定合適的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer 為基礎，確定合適的偶聯蛋白濃度，因為蛋白濃度越高，偶聯到磁珠上的蛋白的量會越大（這是由于 NHS 基團跟蛋白偶聯和 NHS 基團本身水解是一對競爭反應）。當然此處要綜合考慮使用性能和成本，有些客戶偶聯少量的蛋白便可滿足使用需求，這時采用低濃度的蛋白便可，這樣可以降低成本。

4)        封閉這一步可以采用3 M 乙醇胺，也可使用 Tris 緩沖液（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0），封閉時間不得低于 2 h，如果化學封閉后背景仍然很高，還可以額外加一步 BSA 封閉。

3. 蛋白偶聯操作步驟

以下操作過程以取磁珠樣品 400 μL，采用 1.5 mL EP 管為例介紹。用戶可根據自身需求按比例調整。

蛋白溶液配制：取適量待偶聯蛋白用 Coupling Buffer 溶解，配成濃度為≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液。已經保存于 buffer中的蛋白，需要通過透析或者脫鹽的方法徹底除去原有 buffer 里含伯胺基的物質，然后再用 Coupling Buffer 配成濃度為≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，將配制好的蛋白溶液于4℃保存備用。

注： (1)為達到更好的性能，蛋白濃度≥3.0 mg/mL，這樣偶聯效率會更高，此處需綜合考慮成本和使用要求； (2)蛋白溶液中不能含有帶伯氨基的成分，比如 Tris，甘氨酸，明膠，BSA 等；

1)        取 400 μL 25%磁珠懸浮液于 1.5 mL EP 管中。磁分離，去除上清液。

注：磁珠取樣前要反復顛倒、使用渦旋振蕩器使其混合均勻，以保證實驗的同一性，每取一次樣需要重新混勻。

2)        加 1 mL 2~8℃的 Washing Buffer A（①）于離心管中，渦旋 15 s，使磁珠混合均勻。將 EP 管置于磁性分離架內，富集磁珠，去除上清液。

3)        加 200 μL 蛋白溶液于 EP 管中，渦旋 30 s，使其混合均勻。

注：磁珠洗滌后要立即加入蛋白溶液。

4)        將 EP 管渦旋 15 s，置于垂直混合儀上，室溫混合 2~4 h。如果垂直混合不均勻，則反應前 30 min，每隔5 min 取下 EP 管渦旋 15 s。此后，每隔 15 min，取下 EP 管渦旋 15 s。

注：如有需要可以在 4ºC 反應過夜。

5)        采用磁性分離架富集磁珠，保存上清。加 1 mL Blocking Buffer（④）于 EP 管中，渦旋 30 s，將 EP 管置于磁性分離架內，富集磁珠，棄上清液。

注：Blocking Buffer（④）除了試劑盒中提供的 3 M 乙醇胺外，也可以使用 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0 等其它封端試劑。

6)        加 1 mL Blocking Buffer（④）于 EP 管中，渦旋 30 s，將 EP 管置垂直混合儀中室溫反應2 h。將 EP 管置于磁性分離架內，富集磁珠，棄上清液。

7)        加 1 mL 超純水于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。

8)        加 1 mL Storage Buffer（⑤）（比如含 0.05%疊氮化鈉的 PBS 緩沖液，或者客戶根據自己實際需求選合適的保存溶液 ）于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液。重復該操作 2 次。

9)        加入 400 μL Storage Buffer（⑤）于 EP 管中，充分混合，4ºC 保存備用。

注：**偶聯蛋白的磁珠濃度為 25% (v/v)。