PBA-Glu-PBA嵌段共聚物在腦系統(tǒng)中的應(yīng)用

D-葡萄糖(Glu)是體液中必需的能量來源。生理和病理事件中Glu濃度的變化提示可能的生物學(xué)功能障礙。制造可靠的Glu傳感器，特別是涉及大腦功能和神經(jīng)傳遞的傳感器，一直是來自不同學(xué)科的研究人員的長期目標(biāo)。目前Glu選擇性探針可分為兩類:一類是基于利用葡萄糖氧化酶(GOx)水解產(chǎn)物監(jiān)測Glu的策略。另一種方法是將醇與PBA在水介質(zhì)中可逆結(jié)合來檢測Glu。近年來，依據(jù)分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)或GOx的串聯(lián)催化反應(yīng)設(shè)計(jì)的與Glu特異反應(yīng)的探針都依賴于在復(fù)雜樣品中添加探針和傳感Glu，這就增加了立體異構(gòu)體干擾的可能性。為了克服這個(gè)問題，科學(xué)家做出了很多努力，比如用Glu作為連接劑來引起染料的聚集，或者設(shè)計(jì)對Glu更具選擇性的分子結(jié)構(gòu)，但是由于Glu選擇性傳感探針的合成復(fù)雜且困難以及Glu即使被識(shí)別也難以分離等原因，Glu的選擇性和可控性檢測并不容易實(shí)現(xiàn)。受“釣魚”概念—從一個(gè)復(fù)雜的矩陣中捕獲的配體的啟發(fā)，在Glu傳感探針的構(gòu)建中提出 “選擇性捕獲和可控檢測”的策略，設(shè)計(jì)了一種直接靶向的熱納米反應(yīng)器，該反應(yīng)器包含聚合物鏈硼酸單元作為捕獲配體和用于調(diào)節(jié)傳感效率的熱響應(yīng)閥。

匹配的良好親和力和高選擇性需要將識(shí)別元素硼酸單元立體地放置在適當(dāng)?shù)奈恢茫⑶宜鼈兊姆较驅(qū)τ趦?yōu)化捕獲Glu非常重要。受1,2-二醇與PBA可逆共價(jià)結(jié)合的啟發(fā)，提出了一種新機(jī)制，該機(jī)制基于良好的嵌段共聚物聚馬來酸酐苯乙烯-N-異丙基丙烯酰胺-(4-氨基苯基)硼酸[P(MAn-St-NIPAm-PBA)]對于Glu的靶向性。該共聚物通過使用可逆加成-裂解鏈轉(zhuǎn)移法的活性/控制聚合方法實(shí)現(xiàn)。聚合是通過使用引發(fā)劑和鏈轉(zhuǎn)移劑進(jìn)行的。然后通過沉淀和過濾獲得產(chǎn)物PS-MAn，再利用其作為大分子鏈轉(zhuǎn)移劑，逐步實(shí)現(xiàn)P(MAn-St-NIPAm)和P(MAn-St-NIPAm-PBA)的合成。一系列的PBA單元在嵌段共聚物上修飾，自組裝后PBA單元在膠束表面緊密分布，相鄰的PBA單元可以在“正確”的方向與不同的羥基反應(yīng)，以確保PBA-Glu-PBA復(fù)合物的形成。而其他非Glu糖由于不同的立體結(jié)構(gòu)，不與P(MAn-St-NIPAm-PBA)發(fā)生反應(yīng)。與水介質(zhì)中的游離PBA相比，P(MAn-St-NIPAm-PBA)可以選擇性捕獲Glu。且捕獲并從復(fù)雜樣品中分離出Glu后，Glu的pH釋放和納米反應(yīng)器中熱響應(yīng)控制的梯度酶反應(yīng)可對Glu進(jìn)行可控檢測。由于 “選擇性捕獲”步驟消除了Glu立體異構(gòu)體的可能干擾，因此用于Glu檢測的串聯(lián)催化反應(yīng)具有良好的靈敏度和選擇性。此外，熱響應(yīng)控制的酶反應(yīng)將為Glu的可控檢測提供新的途徑。

圖1.納米反應(yīng)器的設(shè)計(jì)。(A) P(MAn-St-NIPAm-PBA)中PBA立體放置從而實(shí)現(xiàn)Glu選擇性捕獲。(B)鼠腦微透析過程示意圖。(C)中空納米反應(yīng)器對Glu的捕獲和釋放過程。(D)以GOx酶和肌紅蛋白（Myo）為催化劑的中空納米反應(yīng)器，通過溫度變化對大鼠腦內(nèi)Glu進(jìn)行監(jiān)測。

在中空P(MAn-St-NIPAm-PBA)納米反應(yīng)器成功形成后，通過測試其直徑在25-40 ℃之間的變化來研究它的熱響應(yīng)滲透閥。從25 ℃加熱到40 ℃后，空心納米反應(yīng)器的尺寸從21.0 nm減小到16.0 nm。此外，納米反應(yīng)器的直徑在冷卻后恢復(fù)到原來的直徑。這種行為至少在五個(gè)周期內(nèi)是可重復(fù)的。結(jié)果表明，納米反應(yīng)器中的可調(diào)閥可以通過改變溫度來控制酶的活性。為了確定空心納米反應(yīng)器的形貌，用透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行測量。TEM顯示，合成的空心P(MAn-St-NIPAm-PBA)納米反應(yīng)器的總體尺寸約為80-100 nm，為規(guī)則的球形，殼厚約為10-15 nm。酶嵌入前后納米反應(yīng)器的原子力顯微鏡（AFM）圖像表明，納米反應(yīng)器自組裝成高28.6 nm、直徑108.0 nm的膠束，與TEM結(jié)果相似。酶嵌入納米反應(yīng)器后，納米反應(yīng)器的AFM圖像顯示其為高度32.1 nm、直徑123.0 nm的完整球體，略大于空心球形膠束。這些結(jié)果證明P(MAn-St-NIPAm-APBA)成功地形成了膠束型納米反應(yīng)器。根據(jù)溫度調(diào)節(jié)的納米反應(yīng)器的閥可以控制酶和底物的滲透性。

圖2.(A)納米反應(yīng)器的熱響應(yīng)特性。(B) (D)空心P(MAn-St-NIPAm-APBA)納米反應(yīng)器的TEM和AFM圖像。(C) (E)含GOx的P(MAn-St-NIPAm-APBA)納米反應(yīng)器的TEM和AFM圖像。

與25 ℃下的酶反應(yīng)相比，在較高溫度（40 ℃）下的游離酶活性略有增加。證明了GOx和Myo兩種酶的串聯(lián)催化反應(yīng)可用于Glu的評價(jià)。在納米反應(yīng)器中嵌入GOx和Myo催化劑，隨后添加底物（Glu和愈創(chuàng)木酚）。使用GOx填充和Myo填充納米反應(yīng)器對Glu進(jìn)行選擇性捕獲和可控傳感。Glu可以被高度選擇性地捕獲并從復(fù)雜的樣品中提取，且通過調(diào)節(jié)pH值（4.0到6.0）釋放。隨后，將GOx填充和Myo填充納米反應(yīng)器應(yīng)用于不同溫度（25或40 °C）下的酶活性研究。在40 °C時(shí)，納米反應(yīng)器的閥門為關(guān)，因此未檢測到GOx和Myo催化劑的酶產(chǎn)物，這表明這些酶在納米反應(yīng)器中被完全屏蔽，Glu和愈創(chuàng)木酚不能進(jìn)入納米反應(yīng)器并被GOx和Myo水解。

圖3.采用GOx和Myo填充納米反應(yīng)器進(jìn)行Glu的選擇性捕獲/釋放和原位可控檢測。

一般來說，對生理上重要物種的高選擇性傳感方法尤為重要。因此將該策略應(yīng)用于監(jiān)測生物腦中Glu。該方法采用Glu初始化的串聯(lián)反應(yīng)，并可通過醌的紫外強(qiáng)度變化來測量Glu。為了測定大鼠大腦中的Glu，制備了不同濃度的Glu溶液，并添加了含GOx的納米反應(yīng)器。在25 °C（pH 6.0）下孵育5分鐘后，分離含有GOx的納米反應(yīng)器并轉(zhuǎn)移到pH 4.0的緩沖溶液中。pH值的變化可以降低納米反應(yīng)器表面PBA靶向基團(tuán)的Glu量。然后，在25 ℃下添加含有Myo和愈創(chuàng)木酚的納米反應(yīng)器溶液。將所得混合物在40 ℃（pH 4.0）下孵育5分鐘，然后檢測紫外光譜，醌強(qiáng)度在470 nm處達(dá)到峰值，并隨著Glu濃度在0.30-10.0 mM范圍內(nèi)線性增加的變化而增加，檢測限為0.20 mM，這表明該方法可用于大鼠腦樣品中的Glu傳感，且納米反應(yīng)器在Glu檢測中表現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性。大鼠全腦缺血(靜息期)術(shù)前2小時(shí)收集大鼠腦微透析液標(biāo)本。術(shù)后20分鐘Glu水平略有下降，術(shù)后2小時(shí)Glu水平下降約25.0 %，與以往報(bào)道一致，再次說明納米反應(yīng)器材料和“選擇性捕獲和可控檢測”策略對大鼠腦微透析液樣品中Glu的分析是非常有選擇性的。

納米反應(yīng)器的溫度響應(yīng)與Glu的線性關(guān)系。(B)靜息、缺血生理?xiàng)l件下大鼠腦微透析液樣品中Glu濃度的變化。

利用GOx和Myo催化劑的靶向性和串聯(lián)催化反應(yīng)成功地證明了熱響應(yīng)納米反應(yīng)器在大鼠腦內(nèi)Glu高選擇性檢測中的應(yīng)用。通過應(yīng)用熱敏特性以及Glu與嵌段共聚物上立體放置的雙硼酸之間的結(jié)合反應(yīng)，使納米反應(yīng)器將成為大鼠腦微透析液樣品中Glu傳感的可靠而的材料

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