熒光顯微鏡技術(shù)的基本原理是利用熒光劑使細(xì)胞成分具有高度具體的視覺效果，如在目的蛋白后面連接一個(gè)通用的熒光蛋白-GFP。在組織樣本中，如果目的基因不能克隆，則需要使用其他技術(shù)手段來觀察目的蛋白，如免疫熒光染色。為此，抗體需要連接各種不同的熒光染料，并直接或間接地與相應(yīng)的靶結(jié)構(gòu)結(jié)合。此外，在熒光染料的幫助下，熒光顯微鏡技術(shù)不僅局限于蛋白質(zhì)，還可以染色核酸、聚糖等結(jié)構(gòu)，即使是鈣離子和其他非生物質(zhì)。本文詳細(xì)介紹了幾種常用的熒光劑。

　　免疫熒光(IF)

　　在熒光顯微鏡技術(shù)中，你可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白：使用內(nèi)源熒光信號(hào)，即通過克隆將熒光蛋白與目的蛋白連接起來;或者將熒光標(biāo)記的抗體特異性與目的蛋白結(jié)合起來。**種方法對(duì)一些生物學(xué)問題更有用或更必要。例如，熒光蛋白不能用于組織樣品，因?yàn)橐话銇碚f，標(biāo)本是從不能保存熒光蛋白的生物體中獲得的。此外，當(dāng)有功能抗體可用時(shí)，免疫熒光法比熒光蛋白技術(shù)快得多，因?yàn)楹笳弑仨毾瓤寺∧康幕颍缓髮NA轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中。熒光蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)是它本身屬于蛋白質(zhì)。因此，這些熒光蛋白在細(xì)胞中具有特定的蛋白質(zhì)特性，會(huì)導(dǎo)致附著的目的蛋白質(zhì)功能障礙或誤解。然而，熒光蛋白技術(shù)仍然是觀察活細(xì)胞的**方法。

　　免疫熒光法利用抗體與相應(yīng)抗原特異性相結(jié)合的特性，有兩種不同的表現(xiàn)形式。最簡單的方法是使用熒光標(biāo)記抗體，它可以與目的蛋白結(jié)合。這種方法被稱為直接免疫熒光法。

　　在許多情況下，我們可以使用兩種不同特性的抗體。**種抗體可以與目的蛋白結(jié)合，但它本身沒有熒光標(biāo)記(**種抗性)。**種抗體本身攜帶熒光染料(**種抗性)，并可以與**種抗性結(jié)合。這種方法被稱為間接免疫熒光法。這種方法有許多優(yōu)點(diǎn)。一方面，它會(huì)產(chǎn)生放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢挂环N二次抗性可以與一種抗性相結(jié)合。另一方面，沒有必要始終用熒光染料標(biāo)記目的蛋白，但市場上可以使用熒光標(biāo)記的二次抗性。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括FITC、TRITC或一些Alexaflur染料，如下所述。

　　FITC和TRITC

　　異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機(jī)熒光染料。目前，該熒光染料仍用于免疫熒光和流細(xì)胞手術(shù)。在495/517nm處，該染料會(huì)產(chǎn)生刺激/發(fā)射峰值，并可與異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與不同抗體結(jié)合。該基團(tuán)可與蛋白質(zhì)上的氨基、硫基、咪唑、酪氨酰、堿基等基團(tuán)結(jié)合。其基本成分-熒光素，摩爾質(zhì)量為332g/mol，常用作熒光示蹤劑。FITC(389g/mol)是熒光顯微鏡技術(shù)中首批用于熒光顯微鏡技術(shù)的染料，被視為后續(xù)熒光染料的起點(diǎn)，如Alexaflur488。該染料的熒光活性取決于其大共軛芳香電子系統(tǒng)，受藍(lán)光譜中光的刺激。

　　另一種經(jīng)常與FITC同時(shí)使用的染料是TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反，TRITC不是熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明還擁有一個(gè)大型共軛芳香電子系統(tǒng)，這導(dǎo)致了它們的熒光行為。另一點(diǎn)是，與FITC相反，TRITC(479g/mol)受綠色光譜中**波長為550nm的光的刺激，其**發(fā)射波長為573nm。它還基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與蛋白質(zhì)(如抗體)結(jié)合。

　　雖然FITC和TRITC仍在使用中，但由于它們**的顯微鏡技術(shù)，因?yàn)樗鼈儗儆诎l(fā)光相對(duì)較弱的熒光染料，其優(yōu)點(diǎn)只是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

　　圖1：果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC;紅色：TRITC。

　　青色素

　　這種熒光染料相對(duì)較少，來自青色素，這也是它名字的起源：Cy2。Cy3。Cy5和Cy7。所有上述青色素都可以通過其反應(yīng)基與核酸或蛋白質(zhì)連接。例如，馬來酰亞胺基團(tuán)用蛋白質(zhì)標(biāo)記。有趣的是，Cy5對(duì)周圍的電子環(huán)境非常敏感，可用于酶測量。附著蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射陽性或陰性變化。此外，Cy3和Cy5也可用于FRET試驗(yàn)。青色素染料是一種相對(duì)較老的熒光染料，但它是其他熒光染料提高亮度、耐光性和量子產(chǎn)率的基礎(chǔ)。

　　AlexaFluor染料。

　　Alexaflur染料是一種帶負(fù)電荷和親水性的熒光染料系列。該系列染料范圍廣泛，常用于熒光顯微鏡技術(shù)。這些染料的名稱是由其**者Richardpaulhaugland以其兒子Alexhaugland的名稱命名的。產(chǎn)品標(biāo)識(shí)為Molecularprobes(美國生命科學(xué)技術(shù)公司Lifetechnologies的子公司。注:2014年2月，Lifetechnogies被Thermofisher收購)商標(biāo)。此外，這些產(chǎn)品標(biāo)識(shí)還涵蓋了相應(yīng)的激光刺激波長。比如Alexaflur488，應(yīng)用范圍廣，**刺激波長為493nm，可由標(biāo)準(zhǔn)488nm激光刺激。Alexaflur48的**波長是59。488類似于FITC的屬性。雖然AlexaFlur488是熒光素衍生物，但與FITC相比，它具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度，pH敏感性較低。所有AlexaFlur染料(如AlexaFlur546.AlexaFlur633)都是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式，如熒光素.香豆素.青色素或羅丹明。

　　圖2:小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎.肢間體節(jié)，E10.5小鼠轉(zhuǎn)基因胚胎的五個(gè)肢間體節(jié):EpaxialMyf5egFP;GFP-Alexa488免疫組化染色;用Desmin-Cy3染色胚胎肌纖維，用Hoechstsize自上而下揭示細(xì)胞核:3.5mm(a)，800μm(b)。圖片來源:AurelieJory，CellulessouchesesesesesesesesesegBMC，IGBMC。

　　圖3:小鼠變成纖維細(xì)胞，綠色:F-Actin，F(xiàn)ITC;紅色:Tubulin，Cy5;藍(lán)色:細(xì)胞核，DAPI。圖片來源:德國·海德爾堡·馬克斯·普朗克研究所·GunterGiese博士。

　　DNA染色

　　在熒光顯微鏡技術(shù)中，不僅研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且核酸也具有重要的研究意義。有時(shí)，細(xì)胞的準(zhǔn)確位置和數(shù)量必須通過檢測細(xì)胞核來確定。最常用的DNA染色劑之一是DAPI(4、6-2-2-2-苯基消炎)，它可以與DNA雙螺旋A-T富集區(qū)結(jié)合。如果DAPI附著在DNA上，其熒光強(qiáng)度將高于自由狀態(tài)。染色劑受**波長為358nm的紫外線刺激，其發(fā)射光譜非常寬，達(dá)到461nm的峰值。此外，弱熒光的RNA結(jié)合也可以檢測到。在這種情況下，發(fā)射波長將轉(zhuǎn)移到500nm。有趣的是，DAPI可以穿透整個(gè)細(xì)胞膜。因此，它可以用于固定和活細(xì)胞。

　　**種廣泛使用的DNA染色劑是Hoechst染料系列，它們最初是由Hoechstag化學(xué)公司生產(chǎn)的。Hoechst33258.Hoechst3342和Hoechst34580均為雙苯酰亞胺，可嵌入A-T富集區(qū)，因此該系列染料很少使用。與DAPI類似，這三種染色劑都能受到**發(fā)射波長為455nm的紫外線刺激，而未結(jié)合的染色劑**發(fā)射波長在510-540nm之間。Hoechst染色劑也具有細(xì)胞滲透性，因此可用于活細(xì)胞或固定細(xì)胞。染色劑和DAPI的區(qū)別在于毒性低。

　　碘化丙啶(Propidium-Iodide，PI)是一種不能通過細(xì)胞膜的DNA染色劑。由于上述特性，染色劑不能進(jìn)入完整的細(xì)胞，因此染色劑通常用于區(qū)分細(xì)胞組中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。此外，碘化丙啶也是一種嵌入劑，但對(duì)于不同的堿基沒有結(jié)合差異。染色劑與核酸結(jié)合后，**刺激波長為538nm，**發(fā)射波長為617nm。未結(jié)合PI的**刺激和發(fā)射波長和光強(qiáng)較低。PI也可以與RNA結(jié)合，無需改變其熒光特性。有時(shí)，為了區(qū)分DNA和RNA，有必要使用適當(dāng)?shù)暮怂崦浮?/p>

　　無需早期處理，就可以識(shí)別DNA和RNA。與DNA結(jié)合后，**刺激/發(fā)射波長為502nm/525nm，而與RNA結(jié)合后，**刺激/發(fā)射波長為460nm/650nm。此外，它還可以進(jìn)入溶酶體和其他酸性區(qū)域。在這里，陽離子染料被質(zhì)子化。在這種酸性環(huán)境下，由藍(lán)色光譜中的光刺激，但發(fā)射波長在橙色區(qū)域**。由于凋亡細(xì)胞有大量被吞噬的酸性區(qū)域，因此常用作這些細(xì)胞的標(biāo)記物。

　　區(qū)室和細(xì)胞器特異性染料。

　　在熒光顯微鏡技術(shù)中，溶酶體、核內(nèi)體等細(xì)胞室和線粒體等細(xì)胞器經(jīng)常被染色。為此，本部分介紹了一系列可供選擇的特異性染料。

　　觀察線粒體最常用的方法是使用Mitotracker，它是一種可以通過細(xì)胞的染料，包括輕度硫基化的氯甲基活性部分。正因?yàn)槿绱耍梢耘c半胱氨酸殘留物的游離硫醇基發(fā)生反應(yīng)，從而與基質(zhì)蛋白結(jié)合。Mitotracker有不同的顏色和裝飾類型(見表1)，此外，它也是Molecularprobes的商標(biāo)。與羅丹明123(Rh123)或tetramethrosamine等常規(guī)線粒體特異性染色劑不同，Mitotracker在用固定劑破壞膜電位后不會(huì)被洗掉。

　　根據(jù)線粒體染色劑，一些染料可以標(biāo)記溶酶體和其他酸性區(qū)域，這被稱為Lysotracker。它們由連接熒光基團(tuán)的弱堿基團(tuán)組成，具有膜穿透性。最有可能的情況是，這些堿基因的質(zhì)子化對(duì)酸性區(qū)域有親和力。Lysotracker有多種不同的顏色可供選擇(見表1)。

　　類似溶酶體的房間是真菌中的液泡，如釀酒酵母，這也是一個(gè)酸性環(huán)境。如果您想在熒光顯微鏡下觀察上述房間，請(qǐng)使用FM4-64或FM5-95等苯乙烯基染料。

　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)對(duì)蛋白質(zhì)分泌實(shí)驗(yàn)具有重要的研究意義。染色上述區(qū)間的**染料是DiOC6(3)。雖然染料更喜歡ER，但它仍然與線粒體和其他細(xì)胞器膜結(jié)合。ER特異性染色的另一種方法是使用ER-Trackergren和Red等ER-Tracker，而ER-Trackergren和Red是基于BODIPY的兩種染料，它們與格列本脲(一種磺酰脲酶)相連，可以與僅存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的ATP敏感鉀通道相結(jié)合。BODIPY(硼-二吡咯亞甲基，boron-diPyromethene)是一種幾乎不溶于水的染料基團(tuán)，對(duì)pH相對(duì)不敏感。這種染料對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記用處不大，但卻是脂質(zhì)和膜標(biāo)記的好工具。

　　對(duì)于與ER相鄰的高爾基體，可以用NBDC6-ceramide、BODIPYFLC5-ceramide等熒光神經(jīng)酰胺類似物進(jìn)行標(biāo)記。上述神經(jīng)酰胺是鞘脂，在高爾基體中高度富集。

　　在基于脂質(zhì)的染料的幫助下，可以對(duì)脂筏等特定膜區(qū)域進(jìn)行染色。使用NBD-6Cholestrol或NBP-12Cholestrol可以觀察膽固醇富集區(qū)(AvantiPolarlipids)。

　　除了使用特異性非蛋白熒光染料來標(biāo)記細(xì)胞區(qū)域外，還可以使用對(duì)細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)來染色目標(biāo)區(qū)域。這些蛋白質(zhì)可以與熒光染料連接，并可以通過熒光顯微鏡觀察到。使用這種方法的一個(gè)例子是麥胚凝集素(WGA)可以與細(xì)胞質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結(jié)合，將WGA與熒光染料連接起來，這樣我們就可以觀察到細(xì)胞質(zhì)膜。

　　圖4：Pukinje細(xì)胞，小鼠小腦皮質(zhì)三重標(biāo)記的縱側(cè)截面圖。紅色：Anti-calbindin-D28k/Cy3;綠色：Anti-GFAP/Cy5;藍(lán)色：Hoechst3258。

　　圖5:牛肺內(nèi)皮細(xì)胞。紅色:用MitotrackerRedCMXRos標(biāo)記的線粒體;綠色:用綠色熒光BODIPYFLPhallacidin標(biāo)記的纖維狀肌動(dòng)蛋白;藍(lán)色:用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。使用三維盲反褶積可以提高圖像質(zhì)量。

　　離子成像

　　在對(duì)神經(jīng)元的研究中，觀察基因活性或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)對(duì)了解細(xì)胞的離子濃度具有重要意義。鈉、鈣、氯或鎂離子對(duì)許多不同的細(xì)胞活性有很大的影響。一般來說，用熒光標(biāo)記的螯合劑可以困住離子，螯合劑結(jié)合相應(yīng)的離子后會(huì)改變離子的光譜特性。例如，利用這一原理的鈣指示劑fura-2.indo-1.fluo-3.fluo-4和calcium-gren。

　　對(duì)于鈉離子的檢測，通常使用SBFI(sodium-bindingbofurzanisophthalate)或Sodiumgren。

　　有趣的是，還有基于蛋白質(zhì)的鈣指示劑，其中一種是基于水母化學(xué)發(fā)光蛋白的水母素。水母素。發(fā)光體腔腸素。分子氧和Ca2+的相互作用會(huì)釋放藍(lán)光，這是熒光蛋白發(fā)現(xiàn)過程中非常有名的機(jī)制。