在光的照射下，某些物質吸收光進入刺激狀態。當從刺激狀態回到基態時，吸收的光能可以以電磁輻射的形式釋放。這種現象稱為光致發光。在這種現象中，如果用短波長光照射物質，它可以在很短的時間內發出比照射光長的波長光，即熒光。熒光素是一些具有這種特性的染料。20世紀40年代，FITC異硫氰酸熒光素標記抗體檢測可溶性肺炎球菌多糖抗原并取得成功。從那時起，創建了免疫熒光抗體標記技術。該技術將抗原抗體反應的高特異性與熒光的敏感性和可測性有機結合，可準確、特異、敏感、快速檢測和定位未知和微量抗原。目前，它已廣泛應用于生命科學研究的各個領域和學科。

　　FITC標記抗體的原理

　　FITC異硫氰酸熒光素是一種常用的標記抗體的方法。FITC一般為黃色。棕色或棕色粉末或結晶，在低溫下可保存數年。在堿性條件下，FITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基結合，形成FITC-蛋白質結合物，即熒光抗體或熒光結合物。抗體分子**可標記15~20個FITC分子。標記的抗體仍能保持與相應抗原結合的能力，在熒光源紫外線或藍紫光的刺激下產生黃綠色熒光，通過熒光顯微鏡觀察或使用流細胞儀進行分析，從而定性、定位或定量抗原。

　　FITC標記抗體方法

　　FITC抗體標記主要包括Marshall直接標記法.Chadwick間接標記法.改進標記法和透析法。

　　Marshall直接標記法

　　抗體準備:取純化Ig溶液測量蛋白質含量，放入三角燒瓶中，加入生理鹽水和0.5mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，在冰箱中攪拌5~10min;

　　熒光素準備：按每毫克蛋白質加0.01~0.02mg的FITC計算，準確稱為取后加入抗體溶液;

　　標記:攪拌時加入熒光素，避免粉末粘附在墻上，放入4℃冰箱或冰庫繼續攪拌12~18h;

　　透析:組合后，將組合物與3000r/min離心20min，去除少量沉淀物，放入透析袋中，然后放入pH8.0緩沖鹽燒杯中透析一夜;

　　過柱：取透析過夜標記，過葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離自由FITC，收集標記熒光抗體進行鑒定。

　　Chadwick間接標記法

　　抗體準備:0~4℃下，用0.01mol/LpH8.0PBS將待標記的抗體蛋白溶液稀釋至30~40mg/ml，放入三角燒瓶中放入冰箱;

　　熒光素準備:按每毫克蛋白質加入0.01mg熒光素，溶解在等量3%重碳酸鈉水溶液中;將抗體蛋白溶液等量與FITC溶液混合，在0~4℃攪拌18~24小時，充分攪拌;

　　透析或柱層分析

　　改良法

　　抗體準備:取純化Ig溶液測量蛋白質含量，放入三角燒瓶中，加入生理鹽水和0.5mol/LPH9.5碳酸鹽緩沖液，在冰箱中攪拌5~10min;

　　熒光素準備：按每毫克蛋白質加0.01~0.02mg的FITC計算，準確稱為取后加入抗體溶液;

　　標記:攪拌時加入熒光素，避免粉末粘附在墻上，放入4℃冰箱或冰庫繼續攪拌12~18h;

　　用半飽和硫酸銨將標記的抗體蛋白沉淀分離，3000r/min離心30min，將上清液中的游離熒光素傾倒，然后用緩沖鹽水透析去除硫酸銨。將準備好的熒光抗體加入0.01%nan3，分裝保存。

　　透析法

　　用0.025mol/LPH9.2碳酸鹽緩沖液將待標記的抗體蛋白稀釋成1%濃度，放入透析袋中;

　　FITC用同樣的緩沖液制成0.1mg/ml溶液，放入圓形容器中，浸泡透析袋，4℃攪拌24h;

　　取出透析袋中的標記液。立即通過G-25或G-50柱葡聚糖凝膠，去除游離熒光素，收集熒光抗體進行鑒定。

　　熒光抗體質量控制

　　FITC熒光標記抗體的質量鑒定，包括特異性和敏感性鑒定。

　　鑒定染色特異性和敏感性

　　特異性染色效率的測定:直接染色時，熒光抗體溶液以1:2.1:4.1:8的比例稀釋，并與相應的抗原標本進行一系列染色。熒光強度在+++的**稀釋度是熒光抗體的染色效率。如果染色效率為1:64，實際染色時可采用1:32或1:16。如果是間接染色效率測定，可以先用不同稀釋度的熒光抗體染色。因此，以抗核抗體熒光強度++為標準

　　非特異性染色：根據熒光抗體的不同用途，類似的抗原切片或涂片可以稀釋熒光抗體。根據常規染色步驟，標本上的非特異性染色應明顯低于特異性染色滴度，否則熒光抗體應通過消除非特異性染色來處理;

　　吸收試驗：在熒光抗體中加入過量的相應抗原，在室溫下攪拌2小時，移入4℃中過夜，3000r/min，離心30min，收集清液，然后用相應的抗原陽性標本染色，結果不應有明顯的陽性熒光。

　　F/P值測定

　　熒光抗體的鑒定一般采用熒光素(F)與抗體蛋白(P)的克分子比，即F/R值，反映熒光抗體的特異性染色質量。實驗要求F/R比為1~2。當過高時，非特異性染色增強;當熒光太低時，熒光很弱，以降低敏感性。具體方法如下:

　　蛋白質定量：確定熒光抗體的蛋白質mg/ml;

　　制作熒光素定量標準曲線：將FITC1mg溶解在10ml0.5mol/lpH9.0碳酸鹽緩沖液中，然后用0.01mol/lpH7.2PBS稀釋到100ml，獲得的熒光素含量為10ug/ml，并將9種不同濃度的溶液不同濃度的溶液。OD值用分光光度計在490nm波長中測量，標準函數圖以光密度為縱坐標，熒光素含量為橫坐標;

　　結合熒光素定量：熒光素與蛋白質結合后，其吸收光譜峰值向長波方向移動約5nm，讀取值后可按公式計算。

　　FITC抗體標記注意事項

　　溫度.時間.pH.熒光素和蛋白質量等都是影響標記效率的因素，需要控制;

　　熒光素及其標記抗體的操作過程應注意避光，攪拌速度應適當避免產生氣泡;

　　注意正確操作，使柱體均勻.柱面平整，無氣泡.裂縫;

　　上樣和洗脫應為前切和后切。前切指柱頂緩沖液與凝膠平面相切時加樣品，后切指樣品與凝膠平面相切時加洗脫緩沖液。

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