單克隆抗體的基本概念、原理、制備工藝和應用

　　1.單克隆抗體的基本概念。

　　單個B細胞克隆產(chǎn)生的高度均勻，僅針對特定抗原位置的抗體稱為單克隆抗體。雜交瘤(hybridoma)抗體技術通常在細胞融合技術的基礎上，將具有特異性抗體分泌能力的致敏性B細胞和具有增殖能力的骨髓瘤細胞融入B細胞雜交瘤。通過將具有這一特征的單個雜交瘤細胞培養(yǎng)成細胞群，可以為抗原位置制備特異性抗體，即單克隆抗體。

　　2.單克隆抗體技術的基本原理。

　　為了制備單克隆抗體，**需要獲得可合成抗體的單克隆B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。實驗發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細胞可以在體外生長和增殖。骨髓瘤細胞與免疫淋巴細胞相結合，通過細胞雜交技術獲得雜種骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承了兩種代際細胞的特征。它不僅具有B淋巴細胞合成抗體的特征，而且具有體外骨髓瘤細胞的培養(yǎng)和增殖的特征。單克隆抗體可由單個融合細胞的細胞組制備。其制備原理如下：

　　3.單克隆抗體制備的基本工藝。

　　(1)免疫動物。

　　免疫動物是利用抗原免疫小鼠產(chǎn)生致敏性B淋巴細胞的過程。一般來說，根據(jù)預先制定的免疫計劃，選擇6-8周齡的雌性Balb/C小鼠進行免疫注射。抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進入外周免疫器官，刺激相應的B淋巴細胞克隆、激活、增殖和分化為致敏性B淋巴細胞。

　　(2)細胞融合。

　　用眼球切除放血法殺死小鼠，無菌手術去除脾臟，擠壓平容器，制備脾細胞懸浮液。將準備好的骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，并添加聚乙二醇。在聚乙二醇的作用下，淋巴細胞可以融合成雜交瘤細胞。

　　(3)選擇性培訓。

　　選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，通常使用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，未融合的骨髓瘤細胞無法通過補救方法合成DNA而死亡。雖然未融合的淋巴細胞包括黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但它們不能在體外長期存活并逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞才能在HAT培養(yǎng)基中生存和增殖，因為它們從脾細胞中獲得次黃嘌呤類嘌呤磷酸核糖轉移酶，具有骨髓瘤細胞的特點。

　　(4)雜交瘤陽性克隆篩查克隆。

　　只有少數(shù)生長在HAT培養(yǎng)基中的雜交瘤細胞是分泌預定單克隆抗體的細胞。因此，必須進行篩查和克隆。雜交瘤細胞的克隆培養(yǎng)通常采用有限稀釋法。陽性雜交瘤細胞可以通過免疫學篩選出能夠產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，并進行克隆擴增。確定單克隆抗體分泌的免疫球蛋白類型、亞類、特異性和親和力后，應及時冷凍。

　　(5)制備單克隆抗體。

　　大量單克隆抗體主要采用動物內誘生法和體外培養(yǎng)法：

　　①體內誘導法采用Balb/c小鼠，先在腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周后，雜交瘤細胞在腹腔接種。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。大約1-2周后，你可以看到小鼠腹部擴張。用注射器提取腹水，獲得單克隆抗體。

　　②體外培養(yǎng)方法將雜交瘤細胞放入培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集和培養(yǎng)上清液，離心去除細胞及其碎片，獲得所需的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，新的培養(yǎng)技術和裝置不斷出現(xiàn)，增加了抗體的產(chǎn)量。雜交瘤細胞應在使用前進行篩選。雜交瘤細胞有兩種：一種是篩選雜交瘤細胞;另一種是篩選雜交瘤細胞，它們可以在初選雜交瘤細胞中產(chǎn)生特異性抗體。這兩種篩選方法和原理不同。

　　4.單克隆抗體制備的應用。

　　生命科學實驗具有醫(yī)學價值，可用于制備單克隆抗體：

　　(1)凝集實驗:haemaglutination。

　　(2)沉淀反應:Precipitationreaction。

　　(3)ELISA等免疫學檢測。

　　(4)親和分析:分離蛋白質。

　　(5)免疫印記(westernbloting)

　　(6)免疫沉淀。

　　(7)BIAcorebiosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白質的親和力。

　　(8)通過放射免疫學檢測免疫復合物。

　　(9)磁珠分離細胞。

　　(10)流式細胞儀:用于細胞分型和細胞分離。

　　(11)臨床疾病的診斷和**。