FITC熒光標記的原理是什么？具體操作步驟如下：

　　(一)原理

　　目前用于抗體標記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)或羅達明(Lissamine rhodamine B200，RB200)。在性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的E氨基共價結合，標記后的抗體仍保持與相應抗原結合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發下產生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞儀分析可對相應抗原進行定性、定位或定量的檢測。

　　(二)操作步驟

　　將純化的IgG抗體對PH9~9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，透析后抗體液移入小燒杯中稱取適量FITC，加入二甲亞碩(DMSO)(FITC-1mg/1ml DMSO)使終濃度為1mgFITC/1mlDMSO FITC/IgG比例：如IgG濃度為1mg/ml，FITC/IgG比例約為50ugFITC/mgIgG;

　　如IgG為5~10mg/m1，則比例為25μgFITC/mlIgG 在10ml小燒杯中先放入抗體

　　按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中將標記物用PBS加至2.5m1，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h。

　　用PD10柱(SephadexG25柱)除去游離熒光素，先用25m1PBS淋洗G25柱收集PBS洗脫**個熒光素結合蛋白峰，測定F/P比值，**個熒光素峰為游離熒光素。

　　計算得：合適的F/P值為2~4。

　　(三)試劑器材

　　1.純化的多克隆抗體或單克隆抗體。

　　2.FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。

　　3.PBS、DMSO 4.PH9~9.5碳酸鹽緩沖液：Na:CO34.3g,NaHCO38.6g加蒸餾水至500ml。

　　5.PD10柱(SephadexG25柱)

　　6.磁力攪拌器，紫外分光光度計等

　　(四)注意事項

　　1.FITC保存于4℃D暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時開蓋稱取，以避免潮解。

　　2.FITC-DMS0液要臨用時配制。

　　3.碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。

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