葫蘆脲類化合物(CBn，n=5–8,10)的超分子主客體復合物的生物成像

葫蘆脲類化合物（CBs，n=5–8,10）是大環主體分子。近年來，越來越多的基于CB的超分子體系被報道，并應用于熒光開關、催化和細胞成像。對于熒光客體分子，主客體配合物通常會影響客體分子在CB腔內的電荷轉移和聚集過程，并導致可調控的光物理性質，如波長偏移和發射增強。作為客體的染料分子的紫外-可見光譜和熒光光譜中的位移可用于生物成像和光熱療法。

葫蘆脲CBs作為宿主可能提供一種新的的策略，將傳統染料的吸收擴展到長波區。三苯胺衍生物已被證明是一種很好的雙光子吸收材料，在傳感和生物成像領域有著廣泛的應用。作為給體基團，它們在不同的給體/受體體系中表現出分子分子內電荷轉移

本文中選擇水溶性三苯胺衍生物（乙烯基吡啶三苯胺）（1）作為客體分子。客體1在水溶液中通過主客體相互作用與CB[7]或CB[8]形成1_CB[7]或1_CB[8]配合物。對于1_CB[7]配合物，客體分子的三個帶正電的吡啶位點被封裝在三個CB[7]的空腔中以形成[1+3]配合物，而三個CB[8]作為主體和兩個1作為客體的[2+3]主客體配合物（二聚體）通過頭對頭堆積（圖1）。CBs的存在導致主客體配合物的紫外-可見光譜和熒光光譜比客體分子本身明顯紅移，這使其成為生物標記應用的合適候選者。值得注意的是，配合物結構的不同導致選擇性染色細胞的不同區域。

三個乙烯基吡啶通過偶連反應連接到三苯胺上，再通過甲基化將疏水性吡啶轉化為親水性吡啶，這為在水中形成1和CBs配合物提供了必要的條件。

我們先通過核磁滴定研究1_CB[7]和1_CB[8]在水中的形成。測定了配合物在不同配比下的核磁共振氫譜（圖2）。隨著CBs的增加，單體1的信號逐漸消失，同時出現了一組新的信號。當化合物1和CB[7]的比例達到1:3時，原始信號完全消失（圖2a）。當1和CB[8]的比率達到2:3時，譜圖中新出現的一組峰趨于穩定。同時，過量的CBs不會引起譜圖的**變化。作者推測得到了1_CB[7]和1_CB[8]的結構。

然后對1_CB[7]（1:3）和1_CB[8]（2:3）的配合物進行了濃度相關研究。結果表明配合物非常穩定，不依賴于濃度。作者認為客體分子與CB[7]形成[1+3]配合物，與CB[8]形成[2+3]配合物。通過電噴霧質譜（ESI-MS）、等溫滴定量熱法（ITC）實驗進一步研究了1和CBs之間的結合行為，結果表明1_CB[7]的化學計量比為1:3，1_CB[8]的化學計量比為2:3。

該主客體配合物可以通過緩慢冷卻接近飽和的配合物水溶液來結晶。主客體配合物的晶體學數據可用CCDC 2059161（1_CB[7]）和2036099（1_CB[8]）。對于1_CB[7]，單晶屬于P63/m空間群，晶胞參數a=29.82?，b=29.82?，c=18.07?，α=90°，β=90°，γ=120°。由于CB[7]的空腔相對較小，因此它只能容納客體分子的一個乙烯基吡啶臂以形成[1+3]配合物（圖3a和c）。對于1_CB[8]，單晶屬于C2221空間群，晶胞參數a=33.50?，b=46.82?，c=85.24?，a=90°，β=90°，γ=90°。如圖3b和d所示，兩個分子1在CB[8]的幫助下以頭對頭堆積形成二聚體。兩個分子之間的距離約為4.4 ?. 三個CB[8]分子位于六個乙烯基吡啶臂的末端，這是由于吡啶具有**的親水作用。單體1中的兩個吡啶部分被封裝在一個CB[8]的空腔中，形成[2+3]配合物。單晶分析結果與核磁共振滴定結果高度一致。此外，CBs與客體分子之間形成配合物的過程會影響客體分子的耦合度和雜化能帶結構，導致不同的電荷轉移行為。因此，將產生不同的光物理性質。

利用紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜進一步研究了1,1_CB[7]和1_CB[8]的光物理性質。隨著CBs的加入，可以觀察到**的變化，這進一步證明了CBs與水溶液中1的強相互作用。如圖4所示，1顯示了472 nm處的主吸收峰和572 nm處的熒光峰。隨著CB[7]的加入，紫外-可見吸收峰從472 nm移動到506 nm（Δ=34 nm），熒光發射峰從572 nm移動到635 nm（Δ=63 nm），熒光強度增加了10倍。對于CB[8]，紫外-可見吸收峰從472 nm移動到543 nm（Δ=71 nm），熒光發射峰從572 nm移動到714 nm（Δ=142 nm）。與1_CB[7]相比，1_CB[8]的紫外可見光譜和熒光光譜發生了更**的變化。溶液的顏色從橙色（1）變為深紅色（1_CB[7]），紫色（1_CB[8]）（圖1）。造成這種現象的原因可能是，主體CBs中羰基的拉電子效應可以中和吡啶的正電荷，這使得吡啶從三苯胺基團中吸收的電子增加，從而導致吸電子和拉電子效應增強。因此可能導致光譜紅移。同時，較大的CB[8]能將兩個客體分子包埋在空腔中，使客體分子穩定聚集形成配合物，從而限制了分子的旋轉。

吡啶衍生物在核酸化學中已被證實具有生物活性。分子動力學模擬也證實了吡啶與DNA的結合。客體分子中陽離子吡啶的存在，通過與糖-磷酸主鏈的靜電相互作用，確保了對DNA的強親和力。考慮到配合物的熒光發射特性和與DNA的親和性，作者進一步研究了配合物作為熒光染料在細胞成像中的應用。為了檢測復合物對細胞的染色性能，分別用1_CB[7]和1_CB[8]水溶液處理海拉細胞。如圖5a-d所示，1_CB[7]在細胞的細胞核和細胞質中都有強烈的發射，說明1_CB[7]配合物可以穿透細胞并與DNA結合。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行的對照實驗顯示了細胞核的彩色位置(圖5a和b)。對于1_CB[8]配合物，熒光主要分布在細胞質區域，而在綠光(561 nm)激發下的細胞核中幾乎看不到輻射(圖5g)。同時對客體1的染色性能進行對照實驗。結果清楚地表明，客體1只能染色細胞核。這說明1,1_CB[7]和1_CB[8]配合物具有良好的細胞通透性和細胞顯像性能。對于1_CB[8]配合物，714nm處的熒光使其適合于熒光細胞染色。動態光散射(DLS)分析表明，1_CB[7] (0.78 nm)和1_CB[8] (2.31 nm)的粒徑不同。考慮到1,1_CB[7]，1_CB[8]在細胞不同染色區域(從細胞核到細胞質)的規律性變化，客體分子和配合物的大小可能是控制細胞染色區域的關鍵因素。采用MTT法對配合物的細胞活力進行了定量分析，表明該配合物具有較好的生物相容性和較低的du性。

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