文獻：具有PD-1膜蛋白的融合混合細胞外囊泡用于胞質貨物運輸

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作者：石川拉賀?奧西德，吉田章介?，澤田新一，佐佐木義弘和秋吉一成*

節選：

材料

桿狀病毒表達系統中常用的秋粘蟲Spodoptera frugiperda的Sf9昆蟲細胞系購自Invitrogen公司（美國加利福尼亞州沃爾瑟姆）。HeLa細胞購自JCRB Bank（日本研究生物資源保藏中心，日本大阪）。 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿 (DOPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸- L -絲氨酸 (DOPS)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(菁 5) (Cy5-DOPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(7-硝基-2-1,3-苯并惡二唑-4-基) (NBD-DOPE) 和 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- N -(麗絲胺羅丹明 B 磺?；? (Rho-DOPE) 均購自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)。

脂質體制備

將DOPC、DOPS、NBD-DOPE、Rho-DOPE和Cy5-DOPE以不同的摩爾比在玻璃微管中的氯仿中混合。在流動的氬氣下蒸發溶劑，形成脂質膜。將膜置于真空干燥器中過夜，以完全去除氯仿。加入250 μL緩沖液（20 mM CH3COOH/CH3COONa（pH 4.5）或10 mM Tris-HCl（pH 7.5））使膜水合，并在27 °C下孵育過夜。使用微型擠出機（Avanti Polar Lipids）將懸浮液擠出100 nm孔徑的聚碳酸酯膜。使用磷脂C測試（Wako，日本大阪）測量脂質濃度。簡而言之，磷脂酶D和膽堿氧化酶從磷脂樣品中產生過氧化氫。產生的過氧化氫在過氧化物酶的作用下促進N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)與4-氨基安替比林發生縮合反應，生成藍色染料，通過測定該染料的吸光度，從而測定樣品中的磷脂濃度。

成像流式細胞術

PD-1 EVs 用 5- 或 6-（ N-琥珀酰亞胺氧羰基）熒光素 3′，6′-二乙酸酯 (CFSE)染色。將 CFSE 添加到 PD-1 EVs 懸浮液中，使其終濃度為 62.8 μM，然后在 37 °C 下孵育 30 分鐘。為了去除游離的 CFSE，使用 100,000 NMWL Amicon 超離心過濾器（Merck Millipore，美國馬薩諸塞州伯靈頓）清洗標記的 PD-1 EVs。以 100:100:1 的 DOPC、DOPS 和 Cy5-DOPE 摩爾比制備脂質體。將 CFSE PD-1 EVs（5 μg/mL）和 Cy5 脂質體（1 μM）在酸性或中性條件下混合，并在 27 °C 下孵育 30 分鐘。通過加入與反應溶液等體積的pH 7.5緩沖液終止融合反應。PD-1雜合胞體外膜通過100nm孔徑的膜擠出。使用ImageStream x MkII（Merck Millipore）采集PD-1雜合胞體外膜的多光譜圖像。激光功率設置為*大值（488nm：200mW；642nm：150mW；785nm（側向散射）：70mW）。熒光信號在通道2（CFSE）或通道5（Cy5）中收集。通道1和通道6分別設置為明場和側向散射。在40倍放大倍數下采集10,000個粒子的熒光強度，并使用IDEAS 6.2軟件進行分析。

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