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單克隆抗體OX26修飾丹酚酸B/黃芩苷納米脂質載體實驗研究

發布時間：2021-05-25 作者：axc 分享到：

〖要點一〗OX26-Sal B/BA-NLC的制備與評價

（1）SalB/BA-NLC的制備：采用乳化-固化法制備OX26-Sal B/BA-NLC。精密稱取Sal B提取物3.5 mg，加入2 mL去離子水溶解，并稱取Myrj 52 300 mg加入到9 mL去離子水中，水浴74 ℃溶解。在磁力攪拌下，將溶解完全的Sal B水溶液加入到Myrj52中，混合均勻，共同構成水相。稱取BA提取物1.5 mg并溶于2 mL無水乙醇中，溶解完全后，加入50 mg卵磷脂，使二者混合均勻；另外稱取Compritol 888 ATO 50mg、Miglyol 81220 mg以及適量的mPEG-MAL與mPEG-OH，加1 mL氯仿使之溶解，并將乙醇溶液與氯仿溶液合并，混勻，構成油相。保持水相在74 ℃的水浴中磁力攪拌，隨之將混合好的油相滴入到水相中。待體系澄清時，降低轉速，繼續攪拌至總體積的1/3，冰水浴2 h。

（2）OX26的硫醇化：采用Traut’s試劑對單克隆抗體進行巰基化[19]。將抗體OX26置于0.15 mol/L硼酸鈉/0.1 mmol/L EDTA緩沖液（pH 8.5）中。混合均勻后，加入Traut’s試劑，加入量根據OX26與2-iminothiolane物質的量比為1∶40計算獲得。磁力攪拌下，沖氮、避光、室溫反應1 h。將反應后的抗體經HitrapTM脫鹽柱洗脫分離，洗脫液為0.01mol/L的HEPES緩沖液（pH 7.0）。

（3）OX26與Sal B/BA-NLC的連接：將上述制得巰基化的OX26與Sal B/BA-NLC混合，按照Maleimide與巰基比為3∶1進行混合?；靹蚝髮⑵浞胖迷诒芄鈼l件下，充氮，磁力攪拌8 h。反應后，以0.01 mol/L的PBS緩沖液（pH 7.4）為洗脫液，過SepharoseCL-4B柱以除去游離的蛋白OX26，即得抗體修飾后的納米?；鞈乙后w系OX26-Sal B/BA-NLC。

〖要點二〗OX26-Sal B/BA-NLC中Sal B及BA的含量測定方法及包封率測定

（1）色譜條件：色譜柱為Diamond Dikmaods C18柱（200mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-乙腈- 0.2%磷酸水溶液（22.5∶22.5∶55）；檢測波長280 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

（2）標準曲線的繪制：分別精密稱取Sal B對照品和BA對照品適量，甲醇溶解并定容，作為儲備液。取適量儲備液，加甲醇配制成SalB質量濃度為1.06、6.10、10.16、28.45、71.12 μg/mL，BA質量濃度為0.72、4.32、7.20、20.16、50.40 μg/mL的混合對照品溶液。按照上述色譜條件，進樣20 μL，記錄其峰面積，以峰面積（A）對質量濃度（C）做圖。得到Sal B的回歸方程為A＝23 231 C－ 6 393.4，r＝0.999 9；BA的回歸方程為A＝72 709 C－11 437，r＝0.999 9。

（3）精密度考察：選取低、中、高3個質量濃度（1.06、10.16、28.45 μg/mL）的混合對照品溶液1 d內重復測定3次，計算日內RSD；連續測定3 d，計算日間RSD。結果顯示，Sal B和BA的日內、日間RSD均小于2%，精密度符合方法學要求。

（4）包封率的測定：實驗選用超濾離心法測定其包封率。將0.2 mL納米制劑加去離子水稀釋至3.0mL，置于超濾離心管中，5000 r/min離心20 min。離心后取外管中的樣品進行HPLC測定，即為W游。另取0.2 mL納米制劑，加入甲醇2.8 mL超聲，5 000 r/min離心20 min，經0.22 μm濾膜濾過，取續濾液經HPLC測定，即為W總。計算Sal B及BA的包封率［包封率＝(W總－W游)/W總，其中W游為載藥NLC中游離**質量，W總為載藥NLC中總的**質量］。

結果顯示，Sal B/BA-NLC中Sal B與BA的包封率分別為（99.79±0.19）%和（89.60±3.53）%，OX26-SalB/BA-NLC中Sal B與BA包封率分別為（95.77±2.42）%和（54.93±5.00）%。

〖要點三〗形態觀察：利用TEM對Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC進行形態觀察。分別取適量的Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC置于銅網上，室溫干燥后，用2%的磷鎢酸對其染色，再次自然干燥。采用TEM觀察并攝制照片，見圖1。結果顯示，Sal B/BA-NLC和OX26-Sal B/BA-NLC粒子多呈圓形，分散較好，且大小均勻。