扁豆凝集素填料LCA/LcH Lens culinaris lectin的應用

        凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質），故名凝集素。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin，PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina，ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素是它們的總稱。

通過鹽析法、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析一系列操作對提取物進行分級分離，篩選富集對H5N1具有**微中和活性的組分，通過電泳發現為包含五種肽段的寡聚蛋白，質譜分析顯示該蛋白質為扁豆凝集素（FRIL）。已有研究表明扁豆凝集素單體具有一個糖結合結構域，但在溶液中的狀態未得到確定，綜合利用多角度光散射、動態光散射、電鏡復染，發現扁豆凝集素為四聚體結構。

進一步在體外定量測定了扁豆凝集素的抗病毒活性，空板減少試驗與微中和試驗顯示PRNT50與EC50約0.7ug/Ml。利用11種流感毒株測定中和譜，發現除實驗室菌株A，扁豆凝集素能以納摩爾水平**不同亞型毒株。研究者通過鼻腔給藥在小鼠體內評估凝集素的作用，凝集素抗病毒活性表現劑量依賴，高劑量給藥能夠明顯延長存活時間甚至保護免受感染。

扁豆凝集素抗病毒活性

扁豆凝集素是已知的甘露糖/葡萄糖特異性凝集素，但關于扁豆凝集素與復雜糖基化的結合機制還有待了解。研究者將接種流感病毒的雞胚進行α-甘露糖酶**劑并在回收時利用切割高甘露糖的內切糖苷酶處理，純化后利用串聯質譜、免疫印跡分析。

 結果發現扁豆凝集素主要結合流感病毒血凝素，而且主要結合復合型糖鏈而不是高甘露糖鏈，這與其他凝集素有很大不同。為了探明這現象背后的機制，研究者利用熒光探針標記的扁豆凝集素，發現與1,3或1,4巖藻糖基化N乙酰葡萄胺的復合型糖鏈結合較好。

凝集素結合糖鏈

進一步分析了扁豆凝集素的抗病毒機制,競爭性微中和試驗發現甲基甘露糖苷和葡萄糖能夠**其中和作用，證實了抗病毒中和效應依賴于糖結合功能。細胞用扁豆凝集素、流感病毒依次分開處理，不能**中和病毒感染，說明扁豆凝集素**病毒進入，必須直接結合病毒粒子才能發揮作用。流感病毒侵入細胞主要是吸附、內吞、脫殼、核轉運這幾個步驟，通過血凝**試驗發現扁豆凝集素不能**病毒的吸附，研究者通過低溫減慢病毒內吞入胞，使病毒吸附在細胞上，加入扁豆凝集素后觀察到明顯的中和效果，而在常溫下病毒發生內吞后無法發揮作用，因此凝集素作用于吸附與內吞之間的過程。利用病毒核蛋白抗體免疫熒光示蹤病毒入胞過程，發現凝集素處理組導致病毒滯留在核周區，通過內體/溶酶體染色顯示病毒停留在晚期溶酶體內，凝集素在溶酶體仍能保持活性，可能發揮阻止病毒核轉運的作用。進一步研究者發現核蛋白免疫熒光表現為大顆粒，且隨著凝集素濃度增加顆粒逐漸變大，推測是凝集素與病毒顆粒間形成多價交聯，聚集成團，從而發揮抗病毒作用。

wyf 03.30