提供一種 FITC標(biāo)記蛋白的使用方法

1.制備溶于0.1M碳酸鈉緩沖液( pH 9.0 )的待標(biāo)記蛋白溶液,濃度≥2mg/ml.

2 )溶解FITC于無水DMSO配制成1mg/ml的溶液。

3 )對于1ml蛋白溶液加入50μFITC溶液,可按照每次5μ的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液;

4 )待所需FITC加入完畢,將反應(yīng)液于4°C避光孵育8h ;

5 )加入NH4CI使其終濃度至50mM , 4°C終止反應(yīng)2h ;

6)加入二甲苯青至濃度0.1% ,甘油至濃度5% ;

7 )通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC ,分離范圍在20,000至50,000 (球蛋白例如抗體)。待凝膠柱平衡后,將以上反應(yīng)混合波從柱頂注入，

打開凝膠柱,待其全部流入柱床后,加入PBS緩沖液。

此時(shí),可以形成兩條帶: a,快速移動帶,也就是FITC-蛋白標(biāo)記物,先被洗脫,通常于室內(nèi)光下可看到; b,慢速移動帶,也就是未結(jié)合蛋白的FITC和二=甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。

8 )于4°C避光儲存上述偶聯(lián)物,加入0.1% ( w/v )疊氮化鈉作為-種防腐劑。若蛋白濃度較低( < 1mg/ml) , 可加入1%BSA作為-種蛋白穩(wěn)定劑。

9)標(biāo)記物中熒光素和蛋白的比值( F/P )可通過測定495nm和280nm處的吸光值來鑒定, F/P應(yīng)位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。

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小編zhn2021.03.22