同位素示蹤技術的樣本制備及其檢測

樣本制備

理想的實驗結果始于精心的實驗設計。對于同位素示蹤實驗，先，穩定同位素的選擇很重要，根據不同研究目的需選擇不同的穩定同位素示蹤劑，以下圖表中列出的同位素示蹤劑可供大家根據各自需求進行選擇。此外，實驗中要控制好各種影響因素，比如體內實驗要注意飼養、空腹、飲食結構等方面；細胞培養則要注意培養基的選擇及培養基的更換時間等；以及同位素示蹤劑的濃度、時間等等。進行同位素示蹤實驗時，一定要避免代謝物之間的交叉干擾，如特殊營養培養基的更換，其余營養物質的濃度要注意是否保持一致。標記感興趣的通路代謝物時，需要注意研究較終目的是獲取動態的物質濃度還是穩態時的物質濃度。一般而言，細胞培養時，糖降解過程達到穩態需要10min，三羧酸循環（TCA）需要超過2h，到達核苷酸則需要24h以上，但不同種類的細胞代謝時間不同。

   有時也需要連續收集樣本去獲取糖降解的動態結果（如10s為一個時間循環），而TCA可設定在15min，30min，60min，120min分別收集樣本。其次，是關于代謝物的收集方法。不同的生物樣本其要求不同，尤其是很多瞬間即逝的重要代謝物，及時的終止代謝過程、獲得準確代謝物信息是實驗的關鍵。常規方法包括冷凍或者酶變性法。細胞實驗經常采用加入低溫有機溶劑降低代謝活性并促使酶的活性永久變性，而組織樣本可以先-80℃凍存再進行低溫有機溶劑提取。如果低溫有機溶劑不能立即終止酶活性應該怎么解決？如NADPH，ATP等這些高能量物質即使緩和降解仍然會引起NADP、ADP、AMP明顯增加。對于這類物質，可以采用添加酸的有機溶劑加速酶變性，比如加入0.1 M甲酸的混合溶劑（乙腈：甲醇：水=40：40：20）。較后，要保證樣本收集的一致性。

樣本檢測

樣本收集后，接下來的挑戰便是盡可能保證檢測結果的準確性。分析技術主要是NMR及MS技術，NMR不僅可以確定化合物上被標記的碳的數量（isotopomer），同時也可確定穩定同位素所標記上的位置（isotopologue），從而追蹤某一代謝物的不同通路來源，但對于混合物分析，NMR解譜相對難度大。如今，越來越多的研究者選擇用MS來檢測，因為其具有更出色的靈敏度、分辨率及特異性等性能。尤其是氣相色譜質譜聯用技術（GC-MS），可以利用硬電離（EI）和軟電離（CI）得到不同的代謝物的碎片信息，從而判斷同位素標記的不同位置。

同時，色譜分離對于同位素示蹤研究尤為重要。色譜分離技術不僅可以將質荷比接近的物質分開，防止其他物質對同位素豐度的影響，同時也可以分離來自不同代謝通路的同分異構體，從而得到準確的代謝通路信息。常見代謝組學平臺分為氣相色譜質譜聯用（GC-MS）和液相色譜質譜聯用（LC-MS）。GC-MS利用其30米，甚至60米的長色譜柱，通常能較好的分離不同的代謝物。LC-MS通過采用不同的色譜柱可以檢測不同種類代謝物，如反相色譜柱C18適用于檢測極性代謝物和脂質，HILIC色譜柱可檢測各類強極性物質。

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