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儲存條件： -20 ℃保存，未開封**期24個月。

產品內容：

一、畢赤酵母感受態細胞的制備

1.活化菌種。-80 ℃保存的菌種在固體YPD培養基平板上劃線，30 ℃培養2-4天。

2.選取酵母菌落接種到10 mL液體YPD培養基中，30 ℃搖床過夜培養后將培養物按1%的接種量接種到100 mL液體YPD培養基中三角瓶中培養至OD值為0.6-1.0。

注：每10 mL菌液可用于一次轉化。以下操作步驟適用于10 mL菌液。

3.3,000 rpm離心3 min收集菌體沉淀。

4.加入5 mL B1溶液重懸菌體，3,000 rpm離心3 min收集菌體沉淀。

5.再加入200 μL B1溶液重懸菌體，轉移到無菌1.5 mL離心管，即為制備好的感受態細胞，可直接用于轉化或凍存備用。

6. 制備好的感受態細胞需緩慢冷凍后，再置于-80 ℃冰箱長期保存。將感受態細胞放入程序降溫盒，或用多層紙包裹放入泡沫盒中，先置于-80 ℃冰箱過夜后，再取出感受態置于-80 ℃冰箱，可保存半年。使用前冰上解凍或直接用于轉化。

注：緩慢冷凍會保證良好的轉化效率。擴大酵母菌培養體積，相應增加凍存液的使用量，可以一次性制備多只畢赤酵母感受態細胞。

二、畢赤酵母轉化

1.取0.1-5 μg質粒DNA（線性化質粒加入量5-50 μg）和10 μL預變性Carrier DNA加入到未融化的感受態細胞上，置于30 ℃水浴，每隔15 s顛倒混勻，直至感受態細胞剛好完全融化。（融化后及時取出）

2.加入1.4 mL B2溶液顛倒混勻。30 ℃水浴60 min。

3.3,000 rpm離心3 min棄上清留菌體沉淀，加入1 mL B3溶液重懸菌體。

4.3,000 rpm 離心3 min 棄上清留菌體沉淀，加入100 μL B3溶液重懸菌體。

5.將100 μL菌液全部涂布到相應的平板培養基，30 ℃恒溫培養3-5天，直至平板出現酵母克隆。

注意事項：初次使用Carrier DNA，請把裝有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5 min，然后立即放在冰上，用后放在-20 ℃儲存備用。下次使用前請于冰上解凍Carrier DNA。反復凍融3-5次后需重新變性Carrier DNA。