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一、概述

His-Tag 蛋白純化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）針對純化 His 標簽蛋白而研制的一種新型純化介質，具有**、快速、方便等特點，可通過磁分離方式直接從生物樣品中一步純化出高純度的目標蛋白，**地簡化純化工藝和提高純化效率，適合科研和工業領域便捷地進行 His-tag 蛋白的純化。對比傳統的過柱層析純化方式， Magarose NTA磁珠通過磁性分離方式純化組氨酸標簽蛋白，無需對粗蛋白樣品進行多次費時費力的離心、過濾步驟，無需裝柱和過柱層析，無需昂貴的柱層析設備，在1小時內便能便捷地獲得高產量和高純度的目的蛋白，且能輕松實現多樣品平行處理，**提高了工作效率，大大降低了設備、時間和人工成本。

本產品系列包括鎳離子（Nickel）和鈷離子（Cobalt）兩種金屬離子螯合磁珠。它們在目標蛋白結合量及所得目標蛋白純度上有所差異，一般推薦客戶使用鎳離子螯合磁珠，大多數情況下能滿足客戶對蛋白載量和純度的要求；對純度要求更高的客戶推薦使用鈷離子螯合磁珠。

His-Tag 蛋白純化磁珠（Magarose-IDA/NTA/TED）磁珠廣泛適用于細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等分泌或胞內表達的可溶性組氨酸標簽蛋白以及變性蛋白的純化。

二、產品特性

注：IDA結合容量高，耐螯合劑差；NTA結合容量較高，耐螯合劑較好；TED結合容量低，耐螯合劑**。

三、使用方法

1. 推薦的緩沖液
2. 可溶性組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

Binding Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 5~20mM咪唑, pH7.4;

Wash Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 20~100mM咪唑, pH7.4;

Elution Buffer: 20mM PBS, 500mM NaCl, 300-500mM咪唑, pH7.4;

1. 包涵體組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

Binding Buffer: 8M Urea, 50mM NaH₂PO₄, 100mM Tris·HCl, pH8.0;

Wash Buffer: 8M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 100 mM Tris·HCl, pH6.3;

Elution Buffer: 8 M Urea, 50 mM NaH₂PO₄, 100mM Tris·HCl, 300-500 mM 咪唑, pH4.5;

Note: Buffer 在使用前需用 0.22 或者 0.45 μm 濾膜過濾除菌。推薦的 Buffer 體系適用于多數組氨酸標簽蛋白的純化，在 Binding Buffer 中添加一定濃度的咪唑可降低非特異性結合，提高目的蛋白的純度。初次使用的客戶可以采用推薦的緩沖液，再根據實驗結果適當調整緩沖液中的咪唑濃度。

2. 樣品準備

2.1組氨酸標簽蛋白樣品準備（在大腸桿菌下非變性條件下可溶性表達）

稀釋重組表達的蛋白：每克大腸桿菌菌體加入5~10 ml binding buffer重懸。樣品和binding buffer含同樣濃度的咪唑可避免宿主細胞表達的含組氨酸的蛋白。同時要去除大顆粒和高濃度的螯合劑，如EDTA，組氨酸、檸檬酸等雜質，防止破壞Ni-NTA樹脂。

1. 酶解：0.2 mg/ml 溶菌酶，20 μg/ml DNase，1 mM MgCl₂，1 mM PMSF（終濃度）或其他蛋白酶**劑。加入的**劑必須對磁珠無影響，4°C混勻30分鐘。
2. 機械裂解：超聲，均質，反復凍融等。
3. 調整裂解液的pH到7.4：不要用強堿或酸調節pH（防止沉淀）。
4. 裂解液離心：將液體轉移到離心管中在室溫或4°C 12000 rpm離心20 min，溫度的選擇取決于蛋白穩定性。
5. 收集上清準備進行后續實驗，或是收集離心后的沉淀準備下一步實驗。
6. 對于在酵母、昆蟲及哺乳動物細胞系統中表達的蛋白，如果有大量的上清液可以用硫酸銨進行蛋白沉淀。用1X PBS透析，加入到磁珠中，如果樣品中不含EDTA，組氨酸，檸檬酸等影響磁珠的成分，可直接上柱。

2.2組氨酸標簽蛋白樣品準備（在大腸桿菌中包涵體表達變性條件純化）

1. 用1×PBS懸浮細胞（每ml細菌沉淀約5 ml 1× PBS），按照上面的超聲條件進行實驗。
2. 裂解液在12,000 rpm離心10 min收集包涵體。用1×PBS洗滌幾次包涵體。
3. 用Binding/Wash buffer溶解包涵體（每ml包涵體約5 ml Buffer），并在室溫下孵育30~60 min。可能需要均質或超聲將沉淀完全溶解。
4. 12,000 rpm離心30 min去除剩余的不溶物。小心的將上清轉移到干凈的管中而不觸碰下面的沉淀。

2.3組氨酸標簽蛋白純化步驟

磁珠的使用量由用戶根據目標蛋白產量和磁珠載量信息計算獲得，這里以獲得 5-10mg目標蛋白為例：

1. 磁珠準備：將Ni-NTA磁珠充分混勻，使用移液器取2 ml 的磁珠懸浮液，（磁珠沉降體積500μl）置于離心管中，磁分離，待溶液澄清，吸棄清液，加入ddH₂O反復清洗，去除酒精。
2. 磁珠平衡：加入5 ml Binding Buffer，反復吹打5-10次，磁分離，待溶液澄清，吸棄清液，重復洗2次。
3. 磁珠與目的蛋白結合：用10 ml Binding Buffer懸浮2 g濕重菌體，進行破損和裂解后，即為目的蛋白粗樣，將粗蛋白破碎液加入磁珠，顛倒混勻。室溫孵育15 min（如目標蛋白不穩定，置于2-8°C下孵育30 min）。
4. 洗雜：置離心管于磁分離器，待溶液澄清，移出上清液，保留以備取樣檢測。向離心管中加入10 ml Wash Buffer，反復吹打5-10次，磁分離，待溶液澄清，吸取上清液，保留以備檢測。重復洗雜步驟3次以上。
5. 洗脫：用戶可根據需要改變洗脫體積調整目標蛋白濃度，加入2-10 ml Elution Buffer 加入到離心管中，重懸磁珠混勻，磁分離，待溶液澄清，吸取上清液，即為目的蛋白組分。重復上述步驟多次，分別收集洗脫組分并留樣檢測，以提高目的蛋白的回收量。
6. 磁珠后處理：加入5 ml Elution Buffer，重懸磁珠，磁分離，吸棄上清，重復該步驟2次。再用5 ml ddH₂O反復清洗3-5次。最后，加入2 ml 20%的乙醇溶液，使總體積等于初始磁珠懸浮液的體積，保存于2-8°C。
7. SDS-PAGE檢測：純化所得樣品用SDS-PAGE 檢測。
8. 磁珠再生：磁珠連續使用三次以上，其結合目標蛋白的能力可能會明顯降低，建議進行磁珠再生處理。

Stripping Buffer: 20 mM Sodium Phosphate, 500 mM NaCl, 100 mM EDTA, pH 7.4

Washing Buffer（可選）: 0.5 M NaOH, 2 M NaCl

Recharge Buffer: 100 mM NiSO₄（該化學試劑有一定的毒性，可能造成過敏反應，使用時務必注意）以5 mL 10%（v/v）磁珠懸液為例，詳細說明磁珠再生操作：

1)        將磁珠懸液磁分離，去除上清，在離心管中加入5 mL ddH₂O，重懸磁珠，磁分離去除上清液。

2)        加入5 mL Stripping Buffer，重懸磁珠，室溫混旋5 min，磁分離，去除上清液。重復此步驟1次。

3)        加入5 mL ddH₂O，重懸磁珠，磁分離去除上清液，重復此步驟 2次。

4)        堿處理：加入5 mL Washing Buffer，重懸磁珠，室溫旋轉混合5 min，磁分離，去除上清液。加入5 mL ddH₂O，重懸磁珠，磁分離，去除上清液。重復 ddH₂O洗滌步驟3~5次，至洗滌液呈中性。

5)        加入5 mL Recharge Buffer，重懸磁珠，室溫旋轉混合20 min，磁性離，去除上清液。

6)        加入5 mL ddH2O，重懸磁珠，磁性離，去除上清液。重復此步驟4次以上，保證鎳離子去除完全。

7)        加入2ml 20%的乙醇溶液，使總體積等于初始磁珠懸浮液的體積，保存于2-8°C。

3．注意事項

1)         磁珠使用和保存過程中應避免冷凍、干燥和高速離心等操作；

2)         使用產品前務必充分振蕩使磁珠均勻懸浮；

3)         磁珠與溶液混合過程中，如果溶液粘稠無法通過翻轉離心管重懸磁珠，可采用移液器反復吹吸或短時漩渦混合使磁珠充分重懸；

4)         用戶可根據實際需要保留經磁性分離移去的上清液，進行取樣檢測，以便分析純化過程和優化蛋白純化流程；

5)         本產品重復使用時建議純化同種蛋白，純化不同蛋白時，建議使用新的磁珠，以防交叉污染；

6)        本產品需與磁性分離器配套使用；

7)        本試劑盒僅用于體外實驗，不能夠用于臨床、**和動物體內實驗等，由此產生的后果概不承擔責任。