阿霉素(doxorubicin,DOX)是一種****,但嚴重的毒副作用而且**細胞對其易產生耐藥,限制了DOX臨床應用。因此建立**靶向、可逆轉耐藥、并能在**細胞內**釋放DOX的遞藥系統是目前研究的熱點。葉酸受體(folate receptor,FR)在多種**細胞表面高表達,經葉酸修飾的遞藥系統具有**主動靶向功能。當**細胞對DOX產生耐藥時,DOX被快速泵出**細胞,不能到達細胞核發揮作用。研究表明,線粒體也是DOX的作用靶點,如果能將DOX定向遞送至線粒體,可**逆轉耐藥,提高DOX的抗**作用。大分子遞藥系統進入**細胞后**分布于內涵體/溶酶體等酸性細胞器中,具有酸敏特性的遞藥載體可實現**的胞內定位突釋。

目的:

本研究利用脂性陽離子(3-丙羧基)三苯基溴化膦(TPP)對線粒體具有高親和力的特性,制備具有線粒體靶向功能的連接物TPP-DOX,并將DOX和TPP-DOX同時包封于葉酸(folic acid,FA)修飾的酸敏聚合物膠束中,以期得到**、低毒、控釋、**逆轉耐藥的DOX聚合物膠束,提高DOX的抗**作用。

方法:

以DOX和TPP為原料合成TPP-DOX。以棕櫚酸(palmitic acid,PA)、聚天門冬氨酸(polyaspartic acid,Pasp)、葉酸(FA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)等為原料,采用腙鍵將親水材料和親脂材料連接,合成酸敏聚合物材料PA-hyd-PEG-FA和Pasp-hyd-PEG-FA。通過核磁、質譜、紅外等方法鑒定化合物結構。分別采用乳化-溶劑揮發法和透析法制備同時包封DOX和TPP-DOX的酸敏膠束DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA和DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA,并對膠束進行表征。將載藥膠束分散于不同p H值的磷酸鹽緩沖溶液中,觀察膠束的體外釋藥特性。采用MTT法研究載藥膠束的體外抗**活性。采用試劑盒法考察載藥膠束對**細胞凋亡的誘導作用。采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察**細胞對膠束的攝取,以及DOX在**細胞亞細胞室的分布情況。建立荷瘤裸鼠模型,考察載藥膠束的體內抗**活性,并采用活體成像儀觀察DOX在荷瘤裸鼠體內的分布。

結果:

1.波譜學鑒定結果顯示合成產物波譜學特性符合目標產物特征。

2.DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA粒徑為237 nm,DOX和TPP-DOX的載藥量分別為8.6%和10.3%,在p H7.4條件下放置4天,膠束粒徑未發生明顯變化。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA在p H值7.4、6.5以及5.0的磷酸鹽緩沖溶液中孵育72 h后,DOX的累積釋放百分率分別為52%、67%以及86%,TPP-DOX的累積釋放百分率分別為51%、65%以及95%,呈現出明顯的p H依賴性。MTT實驗證實,空白膠束無明顯細胞毒性。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA通過葉酸受體介導進入細胞,與游離DOX相比,其細胞毒性**增加,對耐DOX**細胞MCF-7/ADR仍表現出較強的細胞毒性。細胞凋亡實驗結果顯示,DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA可**增加**細胞Caspase 3含量。熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡結果表明,載藥膠束可將DOX**遞送至**細胞內,并實現DOX的線粒體和細胞核定位分布。DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA可提高DOX在**組織的分布,劑量依賴性地**荷瘤(MCF-7/ADR細胞)裸鼠**生長,其體內抗**活性明顯優于游離DOX,并且降低了DOX的毒副作用。

3.DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)的粒徑為193 nm,DOX的載藥量為7.9%,TPP-DOX的載藥量為12.4%。在p H7.4條件下放置30天,膠束的粒徑未發生明顯改變。MTT實驗證實,空白膠束無明顯細胞毒性。DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)體外釋藥具有明顯的p H依賴性,對葉酸受體高表達的KB細胞及耐DOX的MCF-7/ADR細胞均顯示出較強的細胞毒性,且呈現**的誘導凋亡活性。熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡結果顯示,DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)可將DOX轉運至細胞核和線粒體。靜脈注射給予DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)后,DOX主要分布于荷瘤(KB細胞)裸鼠**組織,表現出良好的**靶向特性。DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)可劑量依賴性的**荷瘤裸鼠**的生長,其體內抗**活性明顯強于游離DOX,降低了DOX的心臟毒性。

結論:

DOX/TPP-DOX@PA-hyd-PEG-FA和DOX/TPP-DOX@Pasp-hyd-PEG-FA(Pasp:PEG=1:10)體外釋藥具有酸敏特性,可將DOX遞送至**細胞線粒體和細胞核,增強了DOX的抗**活性,可逆轉**耐藥,減少了DOX在正常組織的分布,降低了DOX的毒副作用。

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發布時間：2022-04-07 lh