綠色熒光素標記牛血清白蛋白BSA-FITC合成詳細步驟
綠色熒光標記牛血清白蛋白的方法可以參考熒光標記抗體的方法,因為抗體也是一種蛋白,具體方法如下:
準備材料:
1、異硫氰酸熒光素(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)異構體I(IsomerI),M.W:389.4發射光譜(吸收光譜)493nm,熒光光譜550nm
2、牛血清白蛋白(BSA),M.W:68000,純度98%。(AlbuminBovineSerum)
3、標記緩沖液:0.5MpH9.5C.B,洗脫液:0.01MpH7.2PBS
標記流程:
1:將待交聯的蛋白(濃度31mg/ml)對交聯反應液透析三次4 ℃,至pH=9.0。交聯反應液配制方法:7.56g NaHCO3,1.06g Na2CO3,7.36g NaCl,加水定容至1 L。
2:將FITC溶于DMSO中,濃度為1mg/ml。每次交聯使用的FITC均應新鮮配制,避光。
3:按P:F(蛋白質:FITC)=1mg:150μg 的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中,邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻,暗處4 ℃反應8 hr。
4:加入5mol/L的NH4Cl至終濃度50mmol/L, 4 ℃終止反應2 hr。
5:將交聯物在PBS中透析四次以上,至透析液清亮。
6:交聯物的鑒定F/P比例: ,該值應介于2.5 ~ 6.5之間。
7:FITC交聯的蛋白應置于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中,加入0.1% NaN3、1% BSA,4℃暗處保存。