牛奶外泌體裝載miRNA204的制備:
電轉(zhuǎn)外泌體裝載 miRNA204: 400 nmol?L -1 miRNA204 與 640 μg 牛奶外泌體混
合于 400 μL 電轉(zhuǎn)緩沖液中, 樣品與電擊杯冰浴 10 min, 樣品中不能有氣泡。 電擊杯放
入電極間進(jìn)行放電, 電壓 350 V, 脈沖時(shí)間累計(jì) 10 ms。 電擊結(jié)束后樣品置于 37 o C 恒溫
箱中 20 min, 恢復(fù)牛奶外泌體膜結(jié)構(gòu)。 由于 miRNA 是線性分子, 選用 10 kDa 的微量超
濾管純化, 超濾管先用 DEPC 水于 7000 r?min -1 潤(rùn)洗 10 min。 樣品于 7000 r?min -1 超濾純
化得到裝載 miRNA204 的牛奶外泌體(mExo-miRNA204) 樣品。 所有操作在避光、 低
溫以及無(wú) RNA 酶環(huán)境下進(jìn)行。
牛奶外泌體裝載miRNA204的表征:
牛奶外泌體對(duì) miRNA204 裝載能力的表征: 用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光定量,激發(fā)波長(zhǎng) 490 nm, 發(fā)射波長(zhǎng) 520 nm, 繪制熒光強(qiáng)度與 miRNA204 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。 miRNA 包封率計(jì)算公式如下:
圖1
純化后樣品 mExo-miRNA204 與等量游離的 miRNA204 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 78 V
電泳 25 min 后用凝膠成像儀拍攝熒光圖像。
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