FITC-D-Lys 合成步驟詳解

一、反應原理

異硫氰酸熒光素（FITC）的異硫氰酸酯基（-NCS）與 D-賴氨酸的 ε-氨基（-NH?）在堿性介質中發生親核加成反應，形成穩定的硫脲鍵（-NH-CS-NH-），生成 FITC-D-Lys 熒光衍生物。

二、實驗步驟

原料準備?

FITC 溶液配制?：將 FITC（1-5 mg/mL）溶解于無水 DMSO 中，避光保存。

D-賴氨酸溶液配制?：將 D-賴氨酸溶解于 0.1 M 碳酸氫鈉緩沖液（pH 8.5）中，確保氨基處于去質子化活性狀態。

偶聯反應?

在避光條件下，將 FITC 溶液緩慢滴加至 D-賴氨酸溶液中，控制 ?FITC/D-賴氨酸摩爾比? 為 1:1 至 1:2（根據標記密度需求調整）。

室溫下持續攪拌反應 ?1-2 小時?，通過 ?pH 維持 8.5? 確保反應高效進行。

反應終止與純化?

終止反應?：通過超濾離心或透析（截留分子量 3.5 kDa）去除未反應的游離 FITC。

初級純化?：凝膠過濾層析（Sephadex G-25 柱），分離 FITC-D-Lys 與未偶聯的小分子雜質。

二級純化?：反相高效液相色譜（HPLC，C18 柱），流動相為甲醇-水梯度體系，收集目標產物峰。

三、質量控制與保存

純度檢測?：通過 HPLC 分析純度（≥95%）及質譜驗證分子量。

儲存條件?：產物凍干后于 -20℃ 避光保存，避免反復凍融；溶解時優先使用 DMSO 或 PBS（pH 7.4）。

關鍵參數與優化建議

參數 設置范圍 優化目標

pH? 8.0-9.0（堿性緩沖液） 提升 FITC 反應活性

摩爾比? FITC=1:1-1:2 平衡標記效率與成本

反應時間? 1-2 小時 避免 FITC 水解副反應

注意事項

避光操作?：FITC 對光敏感，全程需在棕色玻璃器皿或遮光條件下進行。

溶劑選擇?：避免使用含伯胺試劑（如 Tris 緩沖液），以防競爭性反應干擾。

生物相容性測試?：若用于活細胞實驗，需驗證終產物的細胞毒性（如 CCK-8 法）。

通過上述步驟，可高效合成高純度 FITC-D-Lys，滿足蛋白質標記、細菌成像等多種研究需求。

以上資料由小編zhn提供，僅用于科研

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