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產(chǎn)品分類

熒光標(biāo)記

多孔納米

紅細(xì)胞膜囊泡負(fù)載黑磷量子點(diǎn)(BPQD-EMNVs)的實(shí)驗(yàn)研究介紹

發(fā)布時(shí)間：2021-05-06 作者：axc 分享到：

黑磷是一種新型非金屬層狀半導(dǎo)體二維材料，具有從紫外到近紅外的寬吸收光譜。研究人員已對(duì)不同厚度和大小的黑磷進(jìn)行了生物成像和光熱**研究，紅細(xì)胞膜作為一種良好的納米**載體，具有延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、安全無毒和生物相容性好等特點(diǎn) ，得到了研究人員的廣泛關(guān)注。本研究采用紅細(xì)胞膜作為載體，將 BPQD 載入其中，制備負(fù)載黑磷量子點(diǎn) BPQD 的紅細(xì)胞膜納米囊泡（BPQD-loadederythrocyte membrane nanovesicles，BPQD-EMNVs），并對(duì)其理化性質(zhì)和抗**作用進(jìn)行研究，以期為**癥**提供一種新的策略。

一、黑磷量子點(diǎn)(BPQD)的制備:

取 20 mg 黑磷晶體，加入 5 ml NMP 于研缽中研磨至液體顏色發(fā)黑渾濁，然后將其轉(zhuǎn)入圓底離心管中定容至 40 ml。將離心管置于冰浴中，采用細(xì)胞超聲破碎儀進(jìn)行超聲，功率為 500 W，超聲振幅為 30%，超聲 5 s，間歇 5 s，連續(xù)超聲 8 h。接著進(jìn)行水浴超聲，功率為 300 W，超聲振幅為 80%，超聲 8 h。超聲后將樣品 6 000× g 離心 30 min，緩慢吸取上清，繼續(xù)27 000× g 離心 1.5 h，緩慢吸棄上清，取沉淀，保存于 NMP 中防止降解。

二、紅細(xì)胞膜的提取:

ICR 雌性小鼠于動(dòng)物室內(nèi)分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為（21±2） ℃，相對(duì)濕度為 30%~70%，光照 12 h，自由飲食進(jìn)水。選取 6~8 周齡 ICR 雌性小鼠 10 只，眼球摘除取血，裝入經(jīng)肝素鈉預(yù)先淋洗過的 EP 管中；4 ℃、1 200× g 離心 10 min，小心去除白細(xì)胞血清層；加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），清洗紅細(xì)胞 2 次；加入與紅細(xì)胞等體積的預(yù)冷 PBS，4 ℃、1 200× g離心 10 min，小心去除PBS；配制 20 ml 預(yù)冷的 0.25×PBS（低滲液），將其與紅細(xì)胞按體積比 2∶1 混合，反復(fù)吹打數(shù)次置于冰上，冰浴2 h，期間每 0.5 小時(shí)吹打幾次；4 ℃、7 800× g 離心10 min，去除血紅蛋白，EP 管底部粉紅色沉淀即為紅細(xì)胞膜，置于-20 ℃冰箱保存。

三、紅細(xì)胞膜囊泡負(fù)載黑磷量子點(diǎn)(BPQD-EMNVs)的制備

將含有 BPQD 的 NMP 液體以 27 000× g 離心1.5 h，去除 NMP；然后加入適量質(zhì)量濃度為 9 g/L 的NaCl 溶液重懸、吹打分散均勻；加入適量紅細(xì)胞膜溶液，水浴超聲 5 min（300 W、4 000 Hz、**功率），即可獲得 BPQD-EMNVs。

如圖 1 所示，制備的 BPQD鄄EMNVs 在透射電子顯微鏡下呈規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)，粒徑約 200 nm（圖 1A），而用納米粒度及 Zeta 電位儀測(cè)得 BPQD-EMNVs 的

平均粒徑為 228 nm（圖 1B），兩者結(jié)果基本一致。

如圖 2 所示，隨著 BPQD 質(zhì)量濃度的增加，BPQD 的包封率逐漸增加；當(dāng) BPQD 質(zhì)量濃度增至 100 mg/L時(shí)，包封率幾乎不再增加，因此 BPQD鄄EMNVs的 BPQD 包封率約為 47%。

四、細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將紅細(xì)胞膜和 BPQD 分別用 cy5.5 和異硫氰酸熒光素進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后按 1.2.3節(jié)方法制備BPQD鄄EMNVs。將小鼠****細(xì)胞 4T1 以 1×10 5 個(gè)/孔接種于 12 孔板中，加入熒光標(biāo)記的 BPQD鄄EMNVs，于 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育 2 h；去除培養(yǎng)基， PBS 洗3 次，用質(zhì)量濃度為 40 g/L 的多聚甲醛溶液固定10 min；再用 4'，6鄄二脒基鄄2鄄苯基吲哚對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察小鼠****細(xì)胞 4T1 對(duì) BPQD鄄EMNVs 的攝取情況，結(jié)果如圖 3所示，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，在細(xì)胞核周圍有許多紫色熒光，即被**細(xì)胞攝取的 EMNVs，綠色熒光為 EMNVs 內(nèi)的 BPQD，該結(jié)果表明BPQD 可通過EMNVs 被**細(xì)胞攝取。

五、紅細(xì)胞膜囊泡負(fù)載黑磷量子點(diǎn)(BPQD-EMNVs)在**部位富集

如圖 4 所示，通過尾靜脈注射熒光標(biāo)記的BPQD-EMNVs 后，4T1 荷瘤 Balb/c 小鼠**部位的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)，在 4 h 時(shí)熒光強(qiáng)度大，隨后熒光強(qiáng)度漸漸變?nèi)酰?表明在注射 4 h后，BPQD鄄EMNVs 在**部位的富集程度高。

六、動(dòng)物體內(nèi)**實(shí)驗(yàn)

4T1 荷瘤 Balb/c 小鼠分別注射 PBS、EMNVs、BPQD 和 BPQD-EMNVs 4 h 后，用 808 nm 近紅外光對(duì)小鼠的**部位進(jìn)行照射。圖 5 為熱成像儀記錄的**部位溫度隨照射時(shí)間的變化曲線，可以看出照射 10 min 后，PBS 和 EMNVs 組小鼠**部位的溫度無明顯變化，上升了 2~3 ℃，而 BPQD 組小鼠**部位的溫度可升至 43 ℃左右，這可能是由于部分BPQD 聚集至**部位所致。溫度上升大的為BPQD-EMNVs 組，小鼠**部位的溫度可達(dá) 53 ℃左右，該溫度已滿足殺死**細(xì)胞的條件，這也表明 BPQD 可通過 EMNVs 到達(dá)**部位并在**部

位**富集；與 BPQD 組相比，以 EMNVs 作為載體可大大提高 BPQD 在**部位的富集程度。