熒光染色原理及免疫熒光染色簡介

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發生反應時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體(或抗原)上，與其相應的抗原(或抗體)結合后，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。

免疫熒光染色：細胞膜上或細胞內的抗原分子與相應的熒光素標記McAb（單克隆抗體）作用一定時間后形成帶有熒光素的抗原抗體復合物，經激光激發后發出特定的熒光，其熒光強度與被測定抗原分子含量呈比例關系，由此可求得被測細胞與標記McAb（單克隆抗體）相對應抗原的表達量和陽性細胞百分比。

常用的熒光染料：

綠色熒光：FITC（異硫氰酸熒光素）、 Alexa Fluor 488和GFP；

紅色熒光：TRITC（羅丹明）、Cy3（花菁）、Alexa Fluor 568&594和MitoTrackerRed；

藍色熒光：Hoechst、DAPI；

黃色熒光：YFP、Fluo-3和Rhoda-minel23

不同熒光素經激光激發后其發射熒光光譜有差別，因而可將其用于標記不同的McAb（單克隆抗體）進行單色或多色免疫熒光染色。目前，流式細胞術有單色、雙色、三色、四色、五色熒光分析，對細胞的分析更加精密、深入。

免疫熒光染色常用方法：

直接免疫熒光法：用一種（單色）或者多種（多色）熒光素標記的McAb（單克隆抗體）染色細胞后測量其熒光強度和陽性細胞數。

間接免疫熒光法：用一種McAb（單克隆抗體）與細胞作用后，洗去未結合McAb，再加入熒光素標記的**抗體（如羊抗鼠IgG-FITC），染色細胞后測量其熒光強度及陽性細胞數。