熒光素/花菁Cy染料熒光標記DNA與RNA核酸

熒光素（FAM）標記單鏈DNA(FAM-DNA)核酸探針：

MicroRNA（miRNA）是一類長約19至25個核苷酸的非編碼小分子RNA，它在個體生物發育分化等生命活動中有著重要調節作用，并且miRNA的表達與癌癥等重大疾病的發病密切相關，因此實現miRNA的靈敏檢測具有重要的意義。有研究表明，氧化石墨烯（GO）能夠**猝滅多種染料的熒光，并且具有優良的生物相容性、高吸附能力等優點，因此將GO作為熒光的猝滅基團，構建基于GO與染料（或染料標記的生物分子）之間的能量共振轉移體系，已經成為熒光生物傳感器領域的研究熱點。

以熒光素（FAM）標記的單鏈DNA(FAM-DNA)作為核酸探針，加入GO后，由于FAM-DNA探針與GO之間存在較強的π-π堆積效應，因此FAM-DNA探針會迅速的吸附到GO的表面，FAM-DNA探針的熒光素基團與GO發生能量共振轉移，導致FAM-DNA探針的熒光信號被完全猝滅；然而，加入目標分子miRNA時，FAM-DNA探針和目標分子通過堿基配對原則雜交形成穩定的雙鏈結構，當GO存在時，由于雙鏈核酸分子自身的雙螺旋剛性結構，其與GO的結合能力**降低，不會被吸附在GO表面，從而可保持其熒光信號。熒光信號的強弱與體系中miRNA的濃度成正比，從而實現了miRNA的定量檢測。　　

在此基礎上，我們利用酶切放大機制來進一步提高該方法對miRNA檢測的靈敏度。我們引入一種特異性雙鏈核酸酶（DSN），DSN能夠特異性切割完全匹配的DNA雙鏈或者RNA與DNA完全匹配雜交雙鏈中的DNA，對單鏈的DNA或者RNA無任何作用。在上述實驗原理基礎上，當目標分子miRNA與FAM-DNA探針雜交形成穩定的雙鏈結構時，加入DSN酶，DSN酶切割雜交雙鏈結構中的FAM-DNA探針，切碎后的熒光基團不能被GO吸附，同時目標分子miRNA被釋放出來，再次與其它的FAM-DNA探針雜交，DSN酶再切割FAM-DNA探針，如此循環反復進行，實現了一個目標分子與多個FAM-DNA探針循環雜交、切割，大量的熒光基團被釋放出來，體系的熒光信號被**放大，通過檢測體系熒光信號的變化，實現了對miRNA的高靈敏度檢測。該方法實驗原理簡單，背景干擾小，操作快速簡單，可檢測到低至60pM的目標分子miRNA。

Cy5標記核酸片段：

DNA疫苗是一種能夠作為疫苗使用的DNA序列。這一序列來自于病原體，編碼病原體的蛋白。將此序列克隆到真核表達載體上并將構建的重組質粒注入到宿主體內，并使外源基因得以表達，從而激活機體免疫系統，引發抗體反應，可以達到消滅病原體的目的。　　

**、特異地將DNA疫苗導入到抗原遞呈細胞中并使它得到**表達是提高DNA疫苗免疫活性的根本途徑。細菌菌蛻(bacterial ghost，BG)是使用裂解酶將細菌裂解、去除菌體內容物之后形成的空腔。BG周質腔內膜和外膜相互鏈接一個具有完整的細胞膜結構，可用于裝載質粒DNA。BG還能夠被宿主DC識別、吞噬，靶向性將DNA疫苗導入DC細胞，增強DNA疫苗的免疫活性。
　　以BG為載體制備雙重靶向DNA疫苗：首先利用BG將DNA疫苗靶向性的導入樹突狀細胞(DC)、并獲得**表達；其次將編碼抗原的基因片段構建在Ii載體中，內源靶向性地將表達產物遞交給MHC-Ⅱ分子，進一步提高抗原提呈能力和免疫應答水平。

1. 大腸桿菌ghost的制備及鑒定。
　　2.BG裝載核酸片段和質粒DNA，并轉染巨噬細胞RAW264.7
　　 將成功制備的BG與CY5標記的核酸片段按不同濃度混合、孵育，離心收集采用Mito Tracker將BG染色后，流式細胞術檢測裝載效率，發現在**條件下，95％的BG內均裝載了熒光標記的DNA片段。在此基礎上裝載PI染色的質粒pDSRed-N1，裝載效率可達91.98％。將裝載有質粒pDSRed-N1的菌蛻轉染巨噬細胞RAW264.7，轉染48h后采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察RAW264.7細胞內吞BG的過程及Red基因的轉染效率，發現在50-60％轉染細胞中可同時觀察到綠色熒光信號(即Mito Tracker標記的BG)和紅色熒光信號(DsRed編碼的紅色熒光蛋白)。結果提示BG可發揮外源性靶向作用，**地將質粒DNA導入巨噬細胞(抗原提呈細胞)，并獲得較高的表達水平。
　　3.FMDV內源性靶向DNA疫苗的構建
　  4.VP1抗原的表達和純化
　　5.細胞轉染和動物實驗
　　以上結果初步證實，采用BG為載體或將DNA疫苗構建到內源性靶向載體上均可提高疫苗的免疫原性，而采用雙重靶向載體技術可進一步提高DNA疫苗的免疫原性水平。采用本方法制備的疫苗還可以是多價的，首先若以BG裝載2種或多種DNA疫苗，就對多種疾病產生免疫反應；其次若選取特定的致病性細菌制備BG，那么在使用疫苗之后，就可以在DNA疫苗發生作用的同時對特定的致病性細菌產生免疫保護作用。我們相信，隨著雙重靶向疫苗制備技術的完善，本研究策略有可能在未來的新型疫苗研究中發揮重要作用。

熒光標記物：

異硫氰酸熒光素FITC、CY3、CY3.5、CY5、CY7、羅丹明等熒光標記

熒光標記單克隆抗體多克隆抗體或重組抗體

熒光修飾的多肽（各種序列號的多肽、靶向肽、穿膜肽、環肽、序列肽)

熒光標記磷脂（DSPE、DOPE、DMPE、DPPE、DPG、DPPS等磷脂）

高分子聚合物的熒光標記

單糖、多糖、聚糖、寡糖、脂多糖、瓊脂糖熒光標記/近紅外熒光標記

熒光定制標記藥物、小分子、抑制劑、醫藥中間體、生物活性小分子

氨基酸及聚氨基酸的熒光標記

熒光標記DNA與RNA核酸

熒光標記核酸及衍生物

熒光標記核糖、核苷、核酸及其衍生物

熒光標記核酸類藥物（寡核苷酸、質粒DNA、siRNA等）

脂質體的熒光標記

熒光標記空白對照脂質體

熒光標記載藥脂質體

熒光標記裝載DNA或小分子脂質體

熒光標記多室脂質體

熒光標記多囊脂質體

熒光標記免疫脂質體

熒光標記熱敏脂質體

熒光標記PEG化的脂質體

熒光標記配體靶向性脂質體

熒光標記長循環脂質體

熒光標記陽離子脂質體

熒光標記熒光脂質體

熒光標記中性脂質體

熒光標記負電荷脂質體正電荷脂質體

熒光標記磁性脂質納米顆粒

熒光標記載雙藥或者多藥脂質體

熒光標記酸敏脂質體

熒光標記PLGA微球和納米粒子

熒光標記樹狀分子、脂質聚合物

熒光標記冠醚、環糊精、葫蘆脲、杯芳烴衍生物、卟啉、酞菁

熒光標記各種細胞(干細胞、活細胞、細胞核）

碳水化合物的熒光標記

酶與輔酶的熒光標記（溶菌酶、過氧化物酶、脂肪酶）

熒光標記碳納米材料（碳納米管、富勒烯、碳納米角）

金屬與陶瓷材料的熒光標記

熒光標記的微球-紅色、橙色、綠色、藍色、黃色、核酸、紫色

離子液體的熒光標記

熒光標記有機硅化合物（有機硅球、包裹Fe3O4硅球、介孔硅球、載藥硅球）

熒光標記金納米粒子/銀納米粒子

熒光標記二氧化硅納米粒子/氧化鐵納米粒子

熒光標記量子點

磷脂氨基酸的熒光標記

熒光標記可生物降解的聚合物

熒光標記天然聚合物

熒光標記嵌段共聚物

熒光標記親水聚合物

抗體磁珠的熒光標記

超分子材料的熒光標記

蛋白酶抑制劑的熒光標記

雜環的熒光標記

光電材料的熒光標記（有機光電、電子材料、光電中間體、摻雜材料）

熒光標記生物磁珠

造影劑的熒光標記

熒光標記代謝物

熒光標記重組蛋白

熒光標記生物大分子