新型交聯劑琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶/N-羥基琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶NHS–ester diazirine)SDA/LC-SDA /SDAD 衍生物

琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶（succinimidyl ester diazirine,SDA）試劑是一類新型的交聯劑，其可將已被證實的氨基反應化學與創新且**的基于雙吖丙啶的光化學結合，用于將含有氨基的分子交聯到幾乎所有其他功能基團上。SDA交聯劑包括六種化合物，它們具有不同的間隔臂長度，不同的剪切交聯蛋白的能力以及不同的膜通透性（有或無帶電基團）。蛋白交聯是用于研究蛋白結構以及穩定蛋白-蛋白相互作用的重要技術。

在捕獲蛋白相互作用時，雙功能性氨基或巰基反應交聯劑需要兩種蛋白上的特定氨基酸基團（例如，賴氨酸或半胱氨酸）具有適當的間距。SDA交聯劑通過使用氨基反應活性的N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS ester）對一種蛋白進行特定標記，然后使用紫外線活化將雙吖丙啶交聯于**種蛋白的任意氨基酸側鏈或肽段骨架上，從而避開了這一限制。基于雙吖丙啶的光交聯劑較基于苯基疊氮化物的光交聯劑具有更好的光穩定性，并且易于被長波紫外光（330-370nm）活化。

N-羥基琥珀酰亞胺酯雙吖丙啶(NHS–ester diazirine) 衍生物（SDA，LC-SDA 和SDAD ）缺少帶電基團，因此具有膜通透性。此特性使其適于用于細胞內和膜內交聯。相反，Sulfo–SDA，Sulfo–LC–SDA 和Sulfo–SDAD 含有帶負電荷的硫酸根基團，改善了其水溶性并降低了其膜通透性，因此可將其用于細胞外蛋白的交聯。SDAD 和Sulfo–SDAD 的間隔臂中還含有一個二硫鍵，可被還原劑剪切。

使用NHS–Diazirine進行細胞內和細胞外蛋白的光反應性交聯為了證明使用SDA試劑將細胞內蛋白復合體進行光反應性交聯，我們檢測了HeLa細胞中有關早期內吞體抗原1(early endosome antigen, EEA1）蛋白的蛋白相互作用。EEA1通過卷曲螺旋結構域(coiled coil domain) 形成同源二聚體，結合到磷脂囊泡上, 參與內吞體的運輸。細胞用各種NHS-Diazirine衍生物孵育并用紫外光處理。然后將細胞裂解并進行SDS–PAGE分析，使用抗EEA1抗體進行Western blotting 分析。暴露于紫外線后，EEA1遷移率降低的形式僅在SDA和SDAD處理的樣品中檢測到，而在模擬處理對照樣品中未檢測到（如圖）。

NHS-ester diazirine 交聯機制。在pH 值為7-9 的緩沖液中，NHS ester 與伯胺基團（-NH2）**反應形成穩定的酰胺鍵并釋放NHS。使用長波紫外光（330-370）光活化雙吖丙啶形成有活性的碳烯中間體。這樣的中間體通過進一步反應與對應間隔臂長度距離上的任意氨基酸側鏈或肽段骨架形成共價鍵。

由于EEA1是細胞內蛋白復合體，它不會被不透細胞膜的Sulfo–SDA交聯。此外，具有更低遷移率的、SDAD–交聯的EEA1可被還原劑二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT）在間隔臂內剪切。為了說明細胞膜蛋白交聯，我們對比了使用可逆的磺化的N–羥基琥珀酰亞胺–雙吖丙啶（Sulfo–SDAD），磺化的苯基疊氮化物交聯劑（sulfonated phenyl azide, Sulfo–SANPAH）或同源雙功能N–羥基硫代琥珀酰亞胺酯（BS3）處理細胞后異二聚體鈉/鉀（Na/K）ATPase 的交聯情況。樣品使用BCA蛋白定量法標準化蛋白含量，并且使用抗GAPDH的抗體檢測以表明等量上樣。暴露于紫外線后，通過Western Blotting觀察，使用Sulfo–SDAD處理的樣品比使用Sulfo–SANPAH或BS3處理的樣品明顯具有更多的細胞表面Na/Kβ鏈交聯產物。

NHS-Ester Diazirine（SDA）交聯劑在細胞內交聯EEA1 蛋白復合體。HeLa 細胞（2×106） 在PBS 中用1mM 的SDA，Sulfo-SDA，LC-SDA 或SDAD 標記10 分鐘。未反應的NHS ester 用終濃度100mM，pH8.0 的Tris?HCl 淬滅5 分鐘，然后用PBS 洗滌。NHS-diazirine 標記的細胞和模擬處理對照在PBS 中使用Stratalinker2400 在365nm 處紫外線照射15 分鐘，距離為4cm。紫外線處理后，裂解細胞提取蛋白，使用BCA 蛋白定量試劑盒分析總蛋白濃度。除了一個重復的SDAD處理樣品（-DTT）之外，每個樣品取10μg 加入還原性樣品緩沖液，用SDS-PAGE 進行分離。結果使用抗EEA1 抗體通過Western blot 進行分析。

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