電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析法是將酶免疫分析法同電化學(xué)分析結(jié)合的一種分析方法,既有免疫分析的高特異性,又有電分析化學(xué)的高靈敏度。近年來,電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析法得到了越來越多的重視"，常用的方法有流動(dòng)注射分析安培法[2~$、線性掃描伏安法[6~8等。以伏安法檢測酶反應(yīng)的產(chǎn)物,是一種比較快速簡便的方法。

辣根過氧化物酶(HRP)是常用的標(biāo)記酶之一,對HRP測定的關(guān)鍵是選擇合適的底物體系,以達(dá)到較好的靈敏度和檢出限。常用底物的穩(wěn)定性較差，見光或空氣極易被氧化,使得底物的保存及體系的靈敏度受到了限制。近年來,文獻(xiàn){報(bào)道了以鉻黑T為HRP的底物光度法檢測HO，文獻(xiàn)報(bào)道了以酸性鉻藍(lán)K為HRP的電化學(xué)底物,用于HRP的測定。本文發(fā)現(xiàn)HRP可促進(jìn)HO2氧化甲基紅的反應(yīng),且在一定條件下,甲基紅可產(chǎn)生良好的伏安峰,據(jù)此建立了測定HRP的酶聯(lián)伏安分析方法,用于HRP和IgGHRP、Avidin-HRP的測定。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

DS-2005伏安極譜儀，采用三電極系統(tǒng),靜汞電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極,鉑電極為對電極;PHS-3C精密pH計(jì)。

辣根過氧化物酶(HRP,> 250 U mg，上海雪滿生物科技有限公司):準(zhǔn)確稱取0.0100 g HRP,溶解并定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為1.0×10-3g mL4℃冰箱保存,使用時(shí)逐級稀釋;Hz02:4.0×10 3mol h，用時(shí)現(xiàn)配;1.00 mg mL甲基紅:準(zhǔn)確稱量甲基紅0.0500 g,用乙醇溶解并定容至50 mL,使用時(shí)再稀釋至工作濃度;0. 04 molL Briton-Rob-inson (B一R)緩沖溶液: pH值為4.35。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

于5 mL比色管中，依次加入0.20 mL 0. 10mg mL甲基紅,1.50 mL B一R緩沖溶液,2.0 mL 4.0×10 3 molL HO2溶液，一定量的HRP，二次水定容到5 mL，室溫下放置10 min后，以Eo=-0.2 V為起始電位，靜止時(shí)間為5 s,掃描速率為0.3 V /s進(jìn)行陰極化掃描,記錄線性掃描二階導(dǎo)數(shù)伏安圖(圖1)，記錄峰電流(Ip)，同時(shí)做空白(lo)，以△I=(Io一Ip)值進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1酶催化反應(yīng)條件

HRP的反應(yīng)活性與緩沖溶液的pH值有密切

的聯(lián)系,考察了溶液pH值對嗨催化反應(yīng)的影響，當(dāng)pH值在4.10~4.56之間對酶催化反應(yīng)更有利,所以選擇pH 4.35的B一R緩沖溶液作為介質(zhì),且發(fā)現(xiàn)在5 mL試管中加入1.5 mL pH 4.35 B一R緩沖溶液后,可以得到更大且穩(wěn)定的極譜峰電流;同時(shí)考察了緩沖溶液的濃度和甲基紅的濃度對反應(yīng)的影響,其更好用量分別為2.0 mL 4.0×103molLHO2,0.20 mL 0.10 mg mL甲基紅。反應(yīng)時(shí)間的影響試驗(yàn)表明，在室溫下反應(yīng)10 min,測量信號穩(wěn)定﹑精密度好且△I更大。

2.2伏安曲線特性

由圖1可見HRP能催化氧化還原反應(yīng)的發(fā)生,使甲基紅被氧化分解,其平衡濃度降低,對應(yīng)的還原峰電流降低?？疾炝嗽?/span>pH 為4.35的B一R緩沖介質(zhì)中的伏安行為，靜止時(shí)間的影啊買驗(yàn)衣明,在3~9 s的靜止時(shí)間內(nèi),隨著時(shí)間的延長,峰電流有所增加,實(shí)驗(yàn)選擇靜止時(shí)間為5 s;隨著起始電位的負(fù)移,峰電流值減小,實(shí)驗(yàn)選擇起始電位為—0.2 V;當(dāng)掃描速率在0.05~0.30 Vl變化時(shí),當(dāng)掃描速率為0.3 V s時(shí),峰電流大,因此實(shí)驗(yàn)選擇0.3 Vk進(jìn)行掃描。循環(huán)伏安曲線表明(如圖2)，在—0.51 V處有一還原峰,而無對應(yīng)的氧化峰,說明電極過程是不可逆的。且進(jìn)行多次循環(huán)掃描時(shí),峰電流逐漸減小,可見該伏安峰受吸附控制。綜上所述,此伏安過程是受吸附控制的不可逆過程。

2.3 HRP及其標(biāo)記物的測定

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，加入不同量的HRP,繪制HRP質(zhì)量濃度和峰電流的關(guān)系曲線,結(jié)果如圖3所示,HRP在5.0×10-8~5.0× 10 7g hmL之間與△Ⅰ呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為:△Ip(A)=1545.3p(× 107g mL)＋ 107.6，相關(guān)系數(shù)r=0. 9971。對2.0×107 g hmL HRP進(jìn)行11次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%,方法的檢出限為1.8×10 8g mL。

應(yīng)用本體系對羊抗兔(IlgG-HRP)標(biāo)記物進(jìn)行測定,線性范圍為3.3×10-8~4.9×10'g mL(如圖4所示)。其線性回歸方程為:-Ip('A)=352.7P(1.64×10°g mL)—91.82,相關(guān)系數(shù)r=0.9953。

同樣本體系應(yīng)用于Avidin-HRP的測定，Avidin-HRP的稀釋比在16250~1*50000之間與△Ⅰ呈線性關(guān)系(如圖5),更大稀釋比為1*50000,相關(guān)系數(shù)r=0.996。

部分產(chǎn)品列表

zl 02.01