外泌體與靶向載體技術

外泌體作為靶向載體的優勢

　　外泌體和脂質體與納米材料載體相比有很多優勢，例如：低免疫原性，來源于DC的外泌體含有主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類和Ⅱ類分子［23］，因此不會被免疫細胞清除；半衰期長，外泌體表面高表達CD47蛋白，CD47蛋白是一種廣泛表達的整聯蛋白相關跨膜蛋白，是信號調節蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）的配體，CD47-SIRPα結合引發“不要吃我”**吞噬作用的信號，可以防止外泌體被單核細胞或巨噬細胞吞噬，增加外泌體在體內的半衰期；外泌體還具有穿透血腦屏障、胎盤屏障的能力；外泌體可以與傳統的病毒載體結合使用，形成一種功能更強的基因**工具，如Orefice等利用外泌體包裹腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV）載體來靶向**神經退行性疾病，動物實驗獲得了良好的效果，為腦部疾病的**帶來了希望。外泌體載體的以上優勢吸引了越來越多的研究者去研究外泌體載體，拓展了外泌體載體的應用范圍。

外泌體作為靶向**載體的基礎

　　外泌體在細胞間的通訊交流中扮演著重要角色，在人體中，外泌體攜帶著蛋白、核酸和脂質等大量生命信息，需要遵循人體運行的有序性，否則必然會導致人體信息傳遞的錯亂，破壞人體功能的平衡，所以有理由相信外泌體在體內是靶向運輸的，這為開發外泌體的靶向改造提供了可能性。通過改造產生外泌體的母細胞，使其分泌的外泌體膜表面產生靶向目標細胞的蛋白，從而使外泌體產生所需的靶向性，證明可以對外泌體進行靶向性改造。之后越來越多的研究涌向外泌體的靶向**領域。

外泌體的靶向性改造技術

外泌體的產生受親本基因的控制，通過基因工程手段導入融合歸巢蛋白和外泌體的轉膜蛋白的基因到親本細胞中，使得想要的蛋白展示在外泌體膜表面。對外泌體進行靶向改造的過程就是膜蛋白展示的過程。目前已經驗證的轉膜蛋白和歸巢蛋白的組合見表1

歸巢蛋白與在外泌體膜表面已知富集的跨膜蛋白融合，從而展示在外泌體膜表面。對于利用乳凝集素C1C2結構域作為錨定點的組合，因為凝集素是膜相關蛋白，而不是跨膜蛋白，所以使用凝集素C1C2結構域作為外泌體膜表面的錨點沒有利用外泌體的轉膜蛋白可信。以下簡要介紹溶酶體相關膜蛋白2（lysosomal-associated membrane protein，Lamp2）和血小板衍生的生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）的研究。

利用未成熟的DC作為工程化外泌體的來源，通過將狂犬病毒糖蛋白（rabies viral glycoprotein，RVG）基因和一種在外泌體膜表面富集的Lamp2b基因融合，然后利用載體轉染未成熟的DC，獲得表面表達融合蛋白的外泌體，靶向神經系統中的乙酰膽堿受體，將RVG和Lamp2b的基因融合克隆到載體上并轉染未成熟的DC，被展示在外泌體表面的Lamp2b-RVG蛋白將會靶向神經細胞。提純之后的外泌體利用電穿孔的方法裝載 GAPDH-siRNA，靜脈注射結果發現小鼠腦中的神經元、小膠質細胞和少突膠質細胞中的GAPDH基因被敲除，預暴露于RVG-外泌體并沒有導致敲除削弱，除腦以外的其他組織中并未發現非特異性的敲除。使用外泌體裝載siRNA靶向**阿爾茨海默病在小鼠實驗中獲得了較好的結果，與野生型小鼠相比較，靶向**組的小鼠體內的β分泌酶1（β-secretase 1，BACE1）的60%水平的mRNA和62%水平的蛋白質被敲除。證明外泌體不僅可以獲得性地形成靶向性而且可以穿透血腦屏障，已在**阿爾茨海默病方面顯示出巨大潛力。

　 　利用HEK-293細胞作為外泌體的來源，利用特殊的pDisplay載體攜帶靶向基因轉染HEK-293細胞。利用表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和GE11多肽靶向EGFR高表達的****細胞，利用脂質體轉染的方法使外泌體加載siRNA（let-7a miRNA）。pDisplay載體中含有PDGFR跨膜區域，將會促進蛋白質在質膜上的表達。融合基因中設置血細胞凝集素（hemagglutinin，HA）抗體基因標簽，以便于后續的檢測和篩選。GE11是通過噬菌體展示技術篩選出的一種含有11個氨基酸殘基的多肽，能**地靶向結合于細胞膜表面的EGFR受體。該實驗靶向性獲得的策略延續了上述研究，但是該研究利用電穿孔法并不能成功的裝載siRNA到外泌體，認為可能是由于細胞類型不同，分泌的外泌體也有差異。

通過轉膜蛋白和歸巢蛋白相融合的策略能將多肽展示在外泌體膜表面，但是也會有一些問題，例如，展示在外泌體膜表面的歸巢肽有時會被細胞內或體液中的蛋白酶降解從而失去其靶向性，在有靶向性的多肽的N端，利用工程手段加入一個糖基化多肽序列GNSTM可以保護靶向多肽免遭蛋白酶降解，增加在細胞和外泌體中的表達，增強外泌體對靶細胞的靶向能力。另一方面，如果歸巢肽相對分子質量太大，當其和膜蛋白融合的時候，會干擾融合蛋白的表達或正確折疊，因此尋找受體的核心短片段，盡量減少歸巢肽的相對分子質量對于解決外泌體作為靶向**載體的靶向性難題具有重要意義。

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