基于穩定同位素標記和隨時間變化代謝輪廓分析的外源性代謝物檢測和鑒定分析方法

建立高準確度和普適性的外源性代謝物檢測和鑒定分析方法對于評價**等化合物的安全性至關重要。基于液相色譜-四極桿串聯高分辨質譜技術（LC/HRMS/MS），先應用穩定同位素標記目標原型化合物（13C和2H），再進行特征峰識別和配對同位素峰過濾鑒定代謝物，通過代謝物隨時間變化的輪廓分析確證代謝物，建立了高準確度的外源性代謝物檢測和鑒定分析方法。

該研究使用未標記、13C標記和2H標記的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）處理擬南芥屬T87細胞，經液相色譜高分辨質譜分析后進行特征峰識別和配對同位素峰過濾，得到83個候選代謝物，確認了26個2,4-D的代謝物，其中包括10個已報道代謝物和16個新發現的代謝物。

具體研究策略見圖1。

圖1 T87細胞中2,4-D代謝物研究策略

該研究共包括三個數據集：1、未加藥組和2,4-D給藥組；2、2,4-D給藥組和13C8-2,4-D給藥組；3、2,4-D給藥組和2H5-2,4-D給藥組，每組細胞樣品均在加藥0、1、3、7和10天時間點取樣分析。經質譜分析后數據集1得到30853個特征峰，扣除未加藥組內源性特征峰并進行35Cl/37Cl同位素表型分析后，得到潛在代謝物645個，但這其中仍可能包含大量假陽性結果；數據集2得到34559個特征峰，對2,4-D給藥組和13C8-2,4-D給藥組在0、1、3、7和10天時間點的特征峰峰面積輪廓進行統計分析（火山圖分析，log2-fold change>|1|和p<0.05）排除內源性代謝物，得到差異特征峰1626個，再進行同位素特征峰配對過濾（Δm/z 8.0272 Da，質量偏差＜5ppm），得到候選代謝物81個；數據集3分析處理流程與數據集2相同，得到候選代謝物76個。綜合數據集2和數據集3數據，總共得到候選代謝物83個，三個數據集分析流程見圖2。

圖2 數據集分析流程（a, 數據集1；b, 數據集2；c, 數據集3）

對83個候選代謝物進行了鑒定，通過Metabolizer軟件預測了2,4-D可能的所有代謝反應和代謝產物，包括Ⅰ相代謝（氧化/脫烷基化/羥基化）和Ⅱ相代謝（葡萄糖醛酸結合/氨基酸結合/谷胱甘肽結合/硫酸結合）反應，得到7029個推測代謝物。將83個候選代謝物高分辨質譜數據與推測代謝物進行比對（質量偏差＜5ppm），鑒定得到了26個代謝物，其中包括10個已報道代謝物和16個新發現的代謝物。作者等人通過二級質譜特征離子先終確證了16個新發現代謝物的結構。圖3為推測的2,4-D在T87細胞內的代謝途徑和代謝物隨時間變化的代謝輪廓。

圖3 推測的2,4-D代謝途徑（a）和部分代謝物隨時間變化的代謝輪廓（b）

根據代謝反應的不同將鑒定的代謝物分為6組（A-F）。根據每組外源性代謝物隨時間變化代謝輪廓的不同進一步對鑒定的26個代謝物進行了確證（見圖4）。

圖4 各組代謝物（A-F）隨時間變化的代謝輪廓分析

該研究建立的基于穩定同位素標記和代謝物隨時間變化的代謝輪廓分析方法有助于外源性代謝物在生物體內的準確檢測和鑒定，可**減少假陽性率，為全面的外源性代謝物的高通量鑒定提供了參考。

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