在蛋白質骨架上進行翻譯后位點選擇性的氘代標記

氫原子的同位素經常被用來進行標記蛋白質來進行蛋白的功能、結構和機制，然而目前將同位素標記在蛋白上主要是利用分段標記的策略，即利用同位素標記的氨基酸后在進行傳統的肽段合成。這個方法往往會導致標記的某個氨基酸的標記缺乏位點的選擇性，而且需要復雜的工程表達體系。目前還沒有可以直接進行位點選擇性在整個蛋白水平上進行氘代標記的策略。受到烯醇化合物的親核加成反應的啟發，推測可以在氨基酸和蛋白水平上生成α，β不飽和的酰胺，隨后與重水（D2O）反應，從而引入氘代標記。

脫氫丙氨酸（Dha）是一種存在的氨基酸，它可以通過半胱氨酸（Cys）衍生生成。因此認為蛋白中的Cys轉化為Dha后，Dha中的α，β不飽和的酰胺捕獲重水中親電D+，隨后再與硫醇化合物發生邁克爾加成反應，可實現蛋白質位點選擇性的無痕氘代標記。為了使Dha與硫醇化合物S-R反應能夠得到Cys的產物，測試了R=H, Ac和PO32-等時化合物的反應活性和脫保護情況, 發現磷酸化的硫醇化合物均能成功地反應插入和脫保護。先在組蛋白H3的10號Cys位點H3-Cys10進行驗證，利用雙烷基化的脫除試劑DBHDA將Cys轉化為Dha，隨后H3-Hda10在重水環境下與Na3SPO3反應生成H3-[d1]Cys10–S–PO32-，分別可以通過磷酸酶PP1或酸環境脫除磷酸根，得到H3-[d1]Cys10, 其中酶水解1 h后的產率>95%。得到的產物在α位置存在差向異構，其中L:D的比例在1:2。也同樣在H3的26號Cys位點H3-Cys26進行了同樣的反應，也實現了位點選擇性的氘代標記。

之前開發的DBHDA試劑可以選擇性在蛋白中的Cys進行脫除反應生成Dha，然而其中的機制卻不清楚，進一步利用這種氘代標記研究了Cys轉化為Dha中的蛋白化學反應機理。先探究了與蛋白中的Cys反應生成的硫葉立德反應中間體的穩定性以及對隨后的C-H交換反應活性的影響。發現中間體發生消除反應生成的Dha的過程中硫葉立德的生成和相應位點的脫除是密切相關的。還通過密度泛函理論對DBHDA將Cys轉化為Dha過程的可能的過渡態能量進行計算，發現了在消除反應過程中硫葉立德中間體可能存在Swern-like分子內脫質子過程。

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